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猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV2)可引起猪肉芽肿性肠炎,该病可经消化道传播,多致使仔猪腹泻,近年来给养猪业带来一定经济损失。微丝骨架是细胞骨架的重要组成之一,其处于高度变化的动态过程中。它们一般以成束或成网的形式存在于细胞质膜内,参与调控细胞的分裂、黏附、迁移和物质运输等过程。由于病毒的生命进程严格依赖宿主细胞,所以病毒为了创造有利于其入侵、复制、释放和传播的条件,逐渐进化为能与宿主细胞微丝骨架相互作用的类型。既往研究表明,病毒可以利用囊泡运输和/或参与调控微丝骨架的信号通路完成自身的生命进程。本试验以猪小肠上皮细胞系(intestinal porcine epithelial cell line, IPEC-J2)为试验对象,尝试建立了PCV2感染肠道的体外细胞模型,并初步探索了其与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,为今后对PCV2通过消化道感染机制的深入研究奠定基础。1.猪圆环病毒2型对猪小肠上皮细胞感染模型的初步建立本试验以TCID50为104.5/mL的PCV2为试验材料,感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。结果发现,PCV2虽不能引起IPEC-J2细胞产生明显病变；但能引起细胞超微结构的变化。经透射电子显微镜观察,感染后1 h病毒颗粒分散在细胞微绒毛周围；感染后48 h大量病毒颗粒出现在细胞胞质内,线粒体肿胀、基质变浅、嵴变少变短并有形成空泡的趋势。经流式细胞术检测IPEC-J2细胞对PCV2的易感性,发现从1h到72 h感染细胞数呈上升趋势。通过实时荧光定量PCR检测PCV2在IPEC-J2细胞上的增殖情况,在感染6 h至96 h期间PCV2稳定增殖,随后病毒量开始下降。为进一步检测PCV2对IPEC-J2细胞的持续感染力,将感染后的IPEC-J2细胞持续传代,结果发现PCV2可伴随细胞传代至第6代,感染能力呈急剧增长的趋势。以上结果表明,PCV2可以感染IPEC-J2细胞并在细胞内增殖,因此IPEC-J2细胞可以初步作为PCV2感染肠道研究的细胞模型。2.猪圆环病毒2型与猪小肠上皮细胞微丝骨架互作的研究本试验研究了PCV2在感染猪小肠上皮细胞过程中,与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,并对此过程涉及的信号通路进行了初步探索。应用PCV2感染IPEC-J2细胞,以正常未感染的细胞为对照组。分时段检测微丝的变化,荧光显微镜观察发现,对照组细胞的微丝骨架以平行成束的形式排列在细胞内；而感染PCV2的细胞微丝骨架发生了明显的变化：感染后1h,微丝有聚合现象,较多短的丝状肌动蛋白积聚形成小团块；感染后24 h、48 h和72 h,应力纤维减少,丝状肌动蛋白网络呈空洞状,同时细胞界限更加明显。流式细胞术定量发现感染组的微丝总量比对照组在1、24、48和72 h均有极显著的增加(P<0.01)。以微丝解聚剂(细胞松弛素D, CytD)或微丝稳定剂(葫芦素E,CuE)改变细胞微丝的结构,检测细胞内和/或培养上清液中的病毒拷贝数。结果提示,微丝的聚合能促进PCV2侵IPEC-J2细胞；皮质肌动蛋白的重构有利于PCV2从IPEC-J2细胞中释放。为了进一步探索PCV2与微丝骨架的相互作用,我们对此过程涉及的信号通路进行了初步探索。在提取细胞总RNA并反转后,通过实时定量PCR检测微丝相关蛋白在mRNA表达水平上的变化。结果发现：感染后1 h,对照组与感染组所选基因的表达无明显差异；感染后48 h,感染组中与微丝成核有关的凝溶胶蛋白(gelsolin)发生了极显著下调(P<0.01),与应力纤维形成有关的微丝骨架上游调控蛋白RhoA (P<0.01)、ROCK1(P<0.05)和ROCK2 (P<0.05)均存在不同程度的上调,提示PCV2对IPEC-J2细胞微丝骨架的影响可能是通过RhoA-ROCK途径实现的,并在感染过程中伴随微丝成核的现象。