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周围神经损伤(peripheral nerve injuries)是指周围神经干或其分支受到外界直接或间接力量作用而发生的损伤。周围神经缺损的修复仍是临床的一大难题。周围神经损伤后的症状同祖国医学中经络受损相符合,属于“痿症”、“痹症”的范畴。根据传统中医学的经络输穴理论,不少前人将针灸用于周围神经损伤的治疗。针对中医痿症范畴的周围神经损伤后神经修复期应用针刺治疗的研究,已经取得了一定的进展。本项目将在前人研究的基础上进一步探讨针刺对神经损伤后导致肌肉萎缩及神经生长因子(never growth factor,NGF)信使RNA表达的影响,并且从这一角度分析评价不同频率的电针及手针对促进损伤的周围神经再生,防治骨骼肌失神经萎缩及对神经生长因子信使RNA表达的影响。1研究方案1.1动物及分组72只SD大鼠,雄性,体重230-250g,SPF级(由广州中医药大学动物实验中心提供),普通饲料适应性喂养1周后,随机分为4组,电针1组(n=18):疏波,频率:5Hz。电针2组(n=18):密波,频率:100Hz。手针组(n=18):手针。对照组(n=18):制作坐骨神经损伤手术模型,不行治疗。治疗组与对照组均行坐骨神经损伤手术模型,术后第二日开始给予电针及针刺治疗。1.2大鼠坐骨神经损伤模型的复制腹腔麻醉后,用特制纹钳钳夹坐骨神经,持续5S,间歇5s,钳夹三次。术毕分层缝合切口,伤口内注射硫酸庆大霉素2万单位。1.3穴位电针刺激行坐骨神经损伤手术模型后第二日开始给予电针及手针治疗。分别夹在“环跳”、“委中”处的针柄上,每次5分钟,每日2次。电针组输出频率分别为5 Hz和100 Hz,强度以患肢轻微颤动为度,波型分别采用疏密波。手针针刺相同穴位,每次5分钟,每日2次。各组治疗时间分别为1,2,6周。1.4腓肠肌湿重测定各组分别于术后1 W、2 W、6 W,按陈德松法完整取下腓肠肌并称量腓肠肌湿重,以自体健侧作为对照,计算出各自的恢复率。1.5腓肠肌细胞直径测量在称取腓肠肌湿重后,从中点处横切取材石蜡包埋切片,HE染色。在显微镜下随机测量50个肌细胞最大长径和最大横径,取其均值作为肌细胞的直径进行定量分析。1.6肌肉纤颤电位波幅的检测方法使用肌电图仪,采用单极针电极,参照电极置于臀部,记录电极插入腓肠肌内,同一肌肉尽可能多记录纤颤电位(至少20个),测量波幅最大的电位并作统计学处理。1.7坐骨神经的取材方法及NGF mRNA的检测术后1周、2周、6周取各组大鼠神经损伤部位远侧坐骨神经干0.6cm,行常规石蜡切片,厚度为4um,置4℃冰箱保存。应用原位分子杂交实验方法,参照试剂盒的基本步骤进行实验。观察结果:阳性信号呈棕黄色;阴性对照片上无棕黄色阳性信号出现。图像分析应用Axioplan2图像处理系统在放大400倍高倍视野下分析以下指标:(1)神经纤维的总面积(um~2)。(2)阳性信号面积(um~2)。(3)阳性信号面积/神经纤维总面积(%)。(4)阳性信号的平均判断度。(5)平均灰度指数=阳性信号面积百分比与平均灰度的乘积。用公式表示为:平均灰度指数:阳性信号面积百分比(%)×平均灰度。1.8数据库的建立及统计学处理:数据用(?)±s表示,组间比较采用t检验,以上实验结果均用SPSS11.0软件包分析。2结果2.1各组腓肠肌湿重的测量结果(见表1)。各组的腓肠肌湿重的恢复率随实验观察时间的延长均下降,对照组下降速度最明显,电针2组和手针组下降斜度较缓慢。电针1组的下降速度最慢,在各个观察点与对照组比较均出现p＜0.01的显著差异,在2周和6周与手针组比较亦出现p＜0.05的显著差异,说明电针1组治疗效果最好。2.2各组腓肠肌直径和截面积的测量结果(见表2)。各针刺组的腓肠肌直径和截面积与对照组比较均有不同程度的增大,其中电针1组和电针2组在1,2,6周的观察点与对照组比较均有显著差异(p＜0.05)。电针1组在1周与手针组比较亦出现p＜0.05的显著差异,说明电针1组的治疗效果好。2.3各组肌肉纤颤电位波幅的测量结果(见表3)。各针刺组的肌肉纤颤电位波幅在行坐骨神经损伤手术后均下降,并与时间的延长呈反比,但其与对照组比较均有不同程度的增高,其中电针1组、电针2组和手针组在1,2,6周的观察点与对照组比较均有显著差异(p＜0.01)。电针1组在1周与手针组比较亦出现p＜0.05的显著差异,说明针刺治疗效果明显,尤以低频电针最为显著。2.4 NGF mRNA的形态学观察应用原位分子杂交,DAB显色,NGF mRNA阳性信号在切片上呈散在的、棕黄色斑点状。在复染的切片上,神经的其他结构可以显示,阳性信号位于神经纤维鞘的部位;轴索和雪旺细胞核的部位则没有阳性信号。阳性信号的强弱与NGF mRNA表达的量有关。图1为术后第6周大鼠坐骨神经NGF mRNA表达(原位杂交×400)的DAB染色图片,可以看到电针1组NGF mRNA的阳性细胞表达较多,而对照组NGF mRNA的阳性细胞表达较少。2.5治疗前后坐骨神经NGF mRNA表达(见表4)。正常坐骨神经的NGF mRNA表达量极低,平均灰度指数为141.274±35.43。损伤后坐骨神经NGF mRNA表达增高,伤后1周达到一个小的高峰;1～2周,NGF mRNA的表达出现一轻度回落趋势,但2周后又继续升高。针刺治疗后,治疗组各组的NGF mRNA表达较对照组均有不同程度升高,其中电针1组升高幅度最为明显,始终处于高水平,且其在2周和6周与手针组比较亦出现p＜0.05的显著差异,说明低频电针治疗的效果最明显。3结论目前在失神经支配骨骼肌萎缩的研究中,有用单纯药物,针灸或药物加针灸的复合方法等多种研究。本项研究用不同频率的电针及手针对SD大鼠坐骨神经损伤后腓肠肌萎缩的拮抗作用进行研究,更好的证明了针刺治疗对肌肉萎缩的作用。本实验的结果显示低频电针对肌肉萎缩的拮抗作用与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01),腓肠肌湿重的下降斜度随着时间的推移(1、2、6 w)明显减慢。在电生理功能方面,腓肠肌纤颤电位波幅的变化,在1 W、2 w、6 w,低频电针组比对照组的腓肠肌纤颤电位波幅均有不同程度的改善,且他们改善程度之间差异有统计学意义(P＜0.01)。低频电针治疗能有效地拮抗SD大鼠坐骨神经损伤后腓肠肌的萎缩,是促进周围神经损伤后肌肉功能恢复的有效手段。本实验通过不同频率电针及手针的筛选,结果证实低频电针的疗效最佳。在本研究中,治疗组的NGF mRNA表达均有不同程度的增长,其中低频电针的NGFmRNA表达最强,说明5Hz低频电针对促进周围神经损伤再生的效果最佳。这可能是电针的频率不同,兴奋神经纤维的类型不同所致,低频电针可兴奋构成运动神经主干的Ⅰ类、Ⅱ类纤维和Ⅲ类纤维,其疗效更为明显,这也可能是穴位电针促进周围神经再生的形态学机制之一。