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缺血再灌注损伤是器官组织细胞缺血与再灌注期发生的病理生理过程。例如脑缺血超过一定时限,恢复血供后反而加重器官损伤。脑缺血再灌注损伤常导致严重的神经功能障碍,严重影响人类的健康和生命。实验发现,脑缺血再灌注时,大鼠死亡率较高,梗塞侧脑组织含水量明显增加,血清LDH活性升高,脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性降低,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量增加,电镜下脑组织细胞超微结构严重损害。
近年来有学者观察到:脑缺血再灌注时,肥大细胞存在大量活化现象,是引起病变加重的重要因素,脑缺血后肥大细胞出现脱颗粒现象可能在脑缺血再灌注损伤中起了重要作用,而脱颗粒释放的炎症介质又可进一步加重组织的炎症反应,形成恶性循环。肥大细胞还可以通过其释放的生物活性胺组胺、五羟色胺等改变血脑屏障的通透性,促使白细胞迁移入脑内,加重炎症反应,引起组织水肿。
因此,我们设想:在脑缺血一再灌注过程中肥大细胞活化可能是导致脑损伤加重的重要环节之一,干预这一环节,有利于减轻脑损伤。
80年代Kay等首次报道异丙酚可作静脉全麻以来,异丙酚在临床得到广泛使用。有实验证明:异丙酚对实验性大脑缺血的神经损害有保护作用,异丙酚抗缺血/再灌注损伤的主要机制包括:(1)抑制自由基的产生:(2)直接清除自由基,抑制脂质过氧化反应:(3)抑制缺血、缺氧导致的兴奋性谷氨酸受体活化。
另外,一些学者观察到异丙酚对肥大细胞活化和脱颗粒有抑制作用,但用异丙酚在脑缺血.再灌注过程中来干预这一环节进行防治的研究尚未见文献报道。本实验旨在进一步研究异丙酚干预沙土鼠脑缺血/再灌注后氧化产物、炎性细胞因子及脑内肥大细胞标志物组胺和类胰蛋白酶变化,并通过对缺血脑组织光镜及超微结构的观察,进一步说明异丙酚对脑缺血/再灌注损伤有保护作用,为异丙酚在临床上的进一步应用提供理论依据。
材料和方法:
1.动物分组
健康,雄性清洁级蒙古沙土鼠36只,体重55-70g,由浙江省实验动物中心提供,合格证号:0001382。在实验前均在卫生的环境中饲养,自由摄食、饮水。实验操作中,注意消毒及隔离。
沙土鼠随机分为:
A组:假手术对照组(假手术组) 游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。
B组:脑缺血再灌注组(模型组) 游离双侧颈总动脉并阻断脑血流。
C组:模型+异丙酚组在再灌注后,经舌静脉注入异丙酚,用Grassby3000微量泵持续以10mg/kg/hr的速度输注异丙酚2小时。
D组:模型+色甘酸钠50mg/kg组,再灌注后间隔一小时分两次经舌静脉注入。
2.动物模型建立及标本制备
3﹪戊巴比妥钠45mg·kg<'-1>腹腔注射麻醉,待翻正反射消失后将动物仰卧在实验台上,剪开颈部正中皮肤,分离双侧颈总动脉、套线,然后用微动脉夹阻断颈总动脉血流造成脑缺血,脑缺血时间为10min,松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。实验结束后,处死动物快速取出脑组织并取丘脑,10﹪甲醛固定,病理切片(bregma-2.80 to-3.16mm),HE染色光镜观察及免疫组化SP染色类胰蛋白酶表达,剩余脑组织左侧制成组织匀浆,-40℃保存,测定MDA、SOD、17NF-α、IL1-β、组胺等,右侧脑组织分别称湿、干重,Eliot公式计算脑含水量:含水量(﹪)=(湿重一千重)/湿重x 100;四组再各取动物一只,全身灌注后处死动物,快速取出脑组织并取丘脑约1m<'3>大小,经染色后电镜下观察超微结构变化。
3.主要观察批标以下指标:
(1)脑组织含水量。
(2)光镜观察沙土鼠脑组织病理结果,透射电镜观察超微结构。
(3)脑组织MDA含量。
(4)脑组织SOD活性。
(5)脑组织TNF-α浓度。
(6)脑组织IL-1β含量。
(7)脑组织组胺浓度。
(8)脑组织肥大细胞类胰蛋白酶表达、计数。
4.统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有显著性。变量之间采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有显著性。
结果:
1.脑组织含水量模型组脑组织含水量最高,异丙酚与色甘酸钠组脑组织含水量低于模型组(P<0.05)。
2.病理学改变镜下模型组脑组织损伤最重,异丙酚和色甘酸钠两组损伤减轻,假手术组无损伤.
3.脑组织MDA含量MDA含量以模型组最高,与模型组相比,异丙酚组和色甘酸钠组明显降低(P<0.01,0.05).异丙酚和色甘酸钠两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。
4.脑组织SOD活性以模型组最低(P<0.01),异丙酚和色甘酸钠两组SOD活性与模型组比较有统计学意义(P<0.01),与假手术组比较无统计学意义(P>0.05),异丙酚和色甘酸钠两组之间比较亦无统计学意义(P>0.05)。
5.脑组织TNF-α含量TNF-α含量以模型组最高(P<0.01),异丙酚和色甘酸钠两组与假手术组无统计学意义(P>0.05),异丙酚和色甘酸钠两组之间比较亦无统计学意义(P>0.05);
6.脑组织IL-1 β含量与假手术组比较,模型组IL-1含量升高(P<0.01);与模型组相比,异丙酚与色甘酸钠组IL-1含量数值明显下降(P<0.01)。
7.脑组织组胺含量组胺含量以模型组最高(P<0.01),异丙酚组高于假手术组(P<0.05),但和色甘酸钠组之间比较无统计学意义(P>0.05,)。
8.类胰蛋白酶表达免疫组化显示模型组胰蛋白酶大量表达,异丙酚和色甘酸钠两组胰蛋白酶少量表达,与模型组相比明显下降(P<0.01),.
结论:
1.异丙酚在沙土鼠全脑缺血再灌注损伤中有脑保护作用。
2.肥大细胞在脑缺血再灌注损伤的发病过程中起着重要的作用。
3.异丙酚能够通过抗氧化及抑制炎性因子释放影响肥大细胞活化,抑制炎症反应,从而对缺血再灌注脑损伤有保护作用。
4.组胺与MDA、TNF-α、L-1 β等炎性因子或氧化产物在缺血再灌注脑损伤中互相促进了释放,加重了损伤。