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目的:建立人血清中咖啡因及其三种初级代谢产物浓度测定的超高效液相色谱-串联质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)方法,并应用此方法对使用构橼酸咖啡因治疗原发性呼吸暂停早产儿(Apnea of prematurity,AOP)的常规检查剩余血样进行分析。收集咖啡因血药浓度数据、给药信息、采血时间、病理生理数据及CYP1A2基因型,选择合适的协变量,应用非线性混合效应模型法(Nonlinear mixed effects modeling,NONMEM),建立早产儿咖啡因的群体药代动力学(Population pharmacokinetics,PPK)模型,从而为临床安全、合理的用药提供参考。方法:①人血清中咖啡因及其三种初级代谢产物的UHPLC-MS/MS测定方法的建立及验证。选择咖啡因-d9作为内标,取血清50 μL,置于1.5 mL离心管中,精密加入含咖啡因-d9的甲醇溶液200 μL,旋涡振荡1 min沉淀蛋白,静置5 min,于13000 rpm离心10 min,取上清液进行UHPLC-MS/MS分析。标准曲线及质量控制(Quality control,QC)的前处理同样品。色谱柱:Agilent C18柱(2.1 mm×50 mm,2.2 μm);流动相:0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B);流速:0.3 mL/min;梯度洗脱。采用电喷雾离子化(Electrospray ionization,ESI),正离子模式,多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)扫描测定。②早产儿咖啡因PPK模型的建立及验证。收集并测定剩余血样中咖啡因及其三种初级代谢物的浓度,准确记录给药时间、给药剂量和采血时间,查找相应的生理病理等指标。通过NONMEM软件,根据交互作用的条件一阶评估法(First order conditional estimation with interaction,FOCEI)来拟合药动学参数及其变异性,选择合适的个体间变异及残差变异模型,用向前增加法、向后递减法筛选潜在协变量,采用似然比检验(Likelihood ratio test,LRT)各协变量对模型参数的影响,建立最终的群体药代动力学模型并通过图形结合统计学方法进行验证。结果:①建立的UHPLC-MS/MS法测定咖啡因在200～75000 ng/mL,茶碱在10～25000 ng/mL,1,7-二甲基黄嘌呤在10～10000 ng/mL,可可碱在10～2500 ng/mL范围内线性关系良好。日内、日间精密度RSD均≤7.9%,平均回收率在89.2%～109.4%。该分析方法选择性良好、灵敏度高。基质效应、提取回收率、过程效率均符合要求。室温放置24小时、4℃放置2天、-80℃放置16天内均稳定,经过3次冻融循环(-80℃)稳定。②选择一级消除的一房室模型结合个体间变异和残差变异均用指数模型是基础模型的最佳选择。通过在基础模型中将先验的异速生长模型相关系数合并在当日体重(Current weight,CW)考虑(CL取0.75,Vd取1),CW导致目标函数值(Objective function value,OFV)下降117.88(P<0.05);矫正胎龄(Postmenstrual age,PMA)使清除率的OFV下降8.49(P<0.05),血清肌酐浓度(Serum creatinine concentration,CREA)使清除率的OFV进一步下降5.99(P<0.05),通过向后递减显示PMA、CREA对OFV均有显著影响(P<0.05),CYP1A2基因型和其它协变量未导致OFV进一步变化。最终模型关系式如下:CL(L/h)=θ1×(CW/1280)0.75×(PMA/31.1)θ×1/(CREA/68)84 Vd(L)=θ2×(CW/1280)CL:清除率;Vd:表观分布容积;CW:当日体重(g);PMA:矫正胎龄(weeks);CREA:血清肌酐浓度(μmol/L);1280 g、31.1 weeks、68 μmol/L分别是研究人群CW、PMA、CREA的中位数值;θ1、θ2分别是清除率、表观分布容积的群体典型值;θ3、θ4分别是PMA、CREA的固定效应影响因子。结论:建立了一种快速、灵敏的UHPLC-MS/MS分析方法,经验证适用于早产儿常规检查剩余血清中咖啡因及三种代谢产物浓度的测定。通过NONMEM软件建立的早产儿咖啡因群体药代动力学模型,最终模型咖啡因清除率(CL)与矫正胎龄(PMA)、当日体重(CW)和血清肌酐浓度(CREA)相关,表观分布容积(Vd)与当日体重(CW)相关,CYP1A2基因型和其它协变量对咖啡因的群体药代动力学参数均未表现出影响。最终模型经图形结合统计学方法验证具有较好的准确性、适用性和稳定性,可以为早产儿安全、合理的用药提供参考。