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目的:齐墩果酸(OA)是一种从植物中提取的化合物,具有抗肿瘤活性。然而,OA对细胞周期抑制作用的机制还没有完全研究清楚。本研究设计通过几种肺癌细胞探讨OA引起与细胞周期相互作用的分子机制。CCNG1和MEF2D,两者是被公认的miR-122作用靶点,发现在OA作用后表达下调。维持CCNG1和MEF2D蛋白的正常表达可以抑制OA对肺癌细胞抗癌效应。本研究主要证实在肺癌细胞中OA能刺激miR-122转录调节因子表达,验证在肺癌细胞中OA所致的细胞周期阻滞是通过miR-122/CyclinG1/MEF2D途径,有助于阐释齐墩果酸抗肿瘤活性的分子机制。方法:(1)MTT法检测OA处理肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299以及肺癌原始细胞(Primary LC1和Primary LC1)的时间依赖增值率和剂量依赖增值率;(2)Quantitative-PCR检测不同剂量和不同时间的OA处理的肺癌细胞系A549、NCI-H460、NCI-H1299、Primary LC1、Primary LC1和MRC-5细胞中miR-122的表达水平。(3)通过使用miR-122阻断剂,降低miR-122的表达水平观察OA对肺癌细胞A549和Primary LC1的作用。(4)为进一步探讨OA通过miR-122抑制肿瘤细胞增殖的作用,通过Western Blot法检测OA处理过的肺癌细胞中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平。(5)通过转染pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D至A549、Primary LC1细胞,观察OA对CCNG1和MEF2D蛋白的表达的影响。(6)为进一步探讨OA是否增加miR-122的表达水平。Western Blot法检测不同时间段和不同剂量的OA处理过的A549细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表达水平。(7)通过癌细胞种植建立小鼠肺癌模型,通过不同剂量的OA处理种植小鼠,观察肿瘤细胞生长的体积,Quantitative-PCR法检测瘤体中miR-122的表达水平,Western Blot法检测瘤体中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平。结果1.a549、nci-h460、nci-h1299、nci-h1299、primarylc1、primarylc1和mrc-5经过48h的培养,经过0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的oa处理,我们发现随着剂量的增加,出现细胞分化率的下降(a549,10.7-39%,nci-h460,1.3-41.8%;nci-h1299,2-50.4%;primarylc11,4.5-64.3;primarylc2,1.8-46.9%),但是在mrc-5细胞系中没有明显改变。同时我们还发现经30ug/ml浓度的oa处理的细胞系,以时间依赖性抑制细胞生长,同时发现oa加入肺成纤维细胞系mrc-5中,增值速率没有明显的减少。2.quantitative-pcr检测a549、nci-h460、nci-h1299、nci-h1299、primarylc1和primarylc1经过48h的培养,经过0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的oa处理。与con组相比,细胞mir-122的表达水平在15ug/ml组时没有明显的变化,在30ug/ml组时有明显变化(p<0.05),在60ug/ml组时有显著变化(p<0.01)。同时我们还发现经30ug/ml的oa处理的细胞系,与con组相比,细胞mir-122的表达水平在24h组时没有明显的变化,在48h组时有明显变化(p<0.05),在72h组时有显著变化(p<0.01)。3.通过使用mir-122阻断剂antagomir,降低mir-122的表达水平,加入30ug/mloa对a549和primarylc1细胞的作用。研究结果显示:与antagomir/oa(-/-)组相比,(-/+)组中mir-122的表达水平显著增高(p<0.01),细胞增殖率明显下降(p<0.05),其中(+/-)组和(+/+)组没有明显变化。4.为进一步探讨oa通过mir-122抑制肿瘤细胞增殖的作用,经过0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的oa处理a549和primarylc1细胞westernblot结果显示:与0ug/ml剂量组相比,细胞中ccng1蛋白的表达水平在15ug/ml组时明显的降低(p<0.05),在30ug/ml组和60ug/ml组时有显著变化(p<0.01)。与0ug/ml剂量组相比,细胞中mef2d蛋白的表达水平在15ug/ml、30ug/ml组和60ug/ml组时有显著变化(p<0.01)。经过不同时间的30ug/ml剂量的oa处理a549和primarylc1细胞westernblot结果显示:与0h组相比,细胞中ccng1蛋白的表达水平在24h组时明显的降低(p<0.05),在48h组和72hl组时有显著变化(p<0.01)。与0h组相比,细胞中mef2d蛋白的表达水平在24h组时明显的降低(p<0.05),在48h组和72hl组时有显著变化(p<0.01)。5.通过转染pcdna3-ccng1+pcdnamef2d至a549、primarylc1细胞,经30ug/ml剂量的oa处理。westernblot结果显示:与oa/pcdna3-ccng1+pcdnamef2d(-结果:/-)组相比,(-/+)组和(+/+)组中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平显著增高(P<0.01),(+/-)组中CCNG1和MEF2D蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。细胞增值率显示:与OA/pcDNA3-CCNG1+pcDNAMEF2D(-/-)组相比,(-/+)组细胞增值率明显降低(P<0.05),(+/-)组和(+/+)组没有明显变化。6.Western Blot法检测经过0ug/ml、15ug/ml、30ug/ml、60ug/ml剂量的OA处理A549细胞48h培养,Western Blot结果显示:与0ug/ml剂量组相比,细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α蛋白的表达水平在15ug/ml没有明显的改变,其中HNF6蛋白有明显增加(P<0.05);在30ug/ml组和60ug/ml组时有显著的增加(P<0.01)。经过30ug/ml剂量的OA处理培养0h、24h、48h和72h的A549细胞Western Blot结果显示:与0h组相比,细胞中HNF1α、HNF3β、HNF4α蛋白的表达水平在24h没有明显的改变,但是HNF6蛋白有明显增加(P<0.05);在48h组和72h组中HNF1α、HNF3β、HNF4α和HNF6蛋白的表达水平有显著的增加(P<0.01)。7.通过体内试验,通过低剂量(40mg/kg)和高剂量(120mg/kg)的OA处理种植小鼠。肿瘤细胞生长的体积显示:与Con组相比,低剂量组肿瘤体积减少,高剂量组肿瘤体积明显降低(P<0.05);Quantitative-PCR结果显示:与Con组相比,低剂量组瘤体中miR-122的表达水平没有明显改变,高剂量组中miR-122的表达水平显著增高(P<0.01)。Western Blot结果显示:与Con组相比,低剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达明显降低(P<0.05),高剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达显著降低(P<0.01);低剂量组瘤体中MEF2D蛋白表达没有明显改变,高剂量组瘤体中CCNG1蛋白表达显著降低(P<0.01);结论:1.齐墩果酸能降低肺癌细胞的增值率,能提高肺癌细胞的miR-122的表达。2.齐墩果酸能降低肺癌细胞中CCNG1和MEF2D蛋白表达水平3.齐墩果酸通过miR-122/CCNG1/MEF2D路径抑制肺部肿瘤作用。