精子发生是繁殖生物学重要研究内容之一。精子发生过程直接影响产生精子的数量和质量,同时也决定了受精卵生产及苗种培育的成效。自噬,是广泛存在于真核生物细胞中的保守生理过程,当机体在发育分化、组织重建过程中,将会激活自噬信号通路。研究表明,自噬在配子发生中同样发挥重要功能。目前,自噬调控水生生物精子发生机制尚不明确。缝隙连接蛋白可以使离子和小信号分子（＜1 k D）,包括第二信使直接在相邻细胞之间传递。在脊椎动物中的研究发现,缝隙连接蛋白还参与自噬小体形成最初阶段。无脊椎动物中不存在Connexin,对应的无脊椎缝隙连接蛋白Innexin（Inx）形成类似通道结构,在神经系统调控、信号传导、胚胎发育及器官发生等过程起着不可替代的作用。但其在精子发生中的功能尚未得到阐明。实验室前期在曼氏无针乌贼精巢中克隆获得了Innexin4（Inx4）,并发现随着精子成熟其表达量有升高趋势。本论文拟在此基础上,通过形态学、组织学系统揭示曼氏无针乌贼精巢及生殖细胞发育成熟的变化规律;克隆并分析四种Inxs家族基因的c DNA序列;比较四种Inxs基因以及自噬相关基因LC3/BECN1的组织及繁殖期表达特征;重点分析比较Inx4、LC3/BECN1、凋亡相关基因p53/Cas3,及雄性标记基因Sox4/Sox30在精子发生过程中变化规律;结合荧光原位杂交、免疫组化实验分析Inx4基因、LC3蛋白的分布特征;此外,通过自噬抑制模型（100μmol/L、200μmol/L CQ）、自噬增效模型（5μmol/L、10μmol/L RAPA）和RNAi模型（2μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、12μmol/L ds RNA）综合比较自噬抑制/增效和Inx4敲降对曼氏无针乌贼精子发生的影响。主要研究结果如下:1、随着曼氏无针乌贼性腺发育成熟,体重和胴长不断增加;性腺指数GSI和肝脏指数HSI变化趋势基本一致,先升高后降低,且均在Ⅴ期达到最大值,推测与该时期繁殖活动对能量消耗需求的增加有关。组织学研究表明,曼氏无针乌贼精巢属于典型小叶型精巢,精子发生过程中生殖细胞大致经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞、成熟精子5个发育阶段。2、克隆获得了Inxs家族四个基因（Inx2、Inx4、Inx8 A和Inx9 A）的c DNA序列。Inxs蛋白序列具备缝隙连接蛋白的典型特征,包括四个跨膜结构域,第一和第二细胞外环和一个胞内环。在第二个跨膜结构域周围,每个连接蛋白都有一个P-X-X-X-W motif,且细胞外环中存在保守的半胱氨酸（Cys）残基。进化关系分析发现同一物种内Inxs蛋白氨基酸序列高度同源,不同物种之间进化关系相对较远。四种Inxs基因均在精巢、脑、视叶中出现高表达,精巢中的表达量远高于卵巢,雄性脑远高于雌性脑。除Inx9 A外,Inx2、Inx4和Inx8 A在雄性视叶中的表达量也显著高于雌性视叶。推测四种Inxs基因在精子发生,脑、视叶神经系统发育及调控过程中发挥重要作用。随着精巢发育成熟,四种Inxs基因均先升高后降低,表达峰值出现在Ⅴ至Ⅵ期。其中,Inx2、Inx4表达模式最为相近,最高表达量出现在Ⅴ（41g）期;Inx8 A、Inx9 A表达模式最为相近,最高表达量出现在Ⅴ-Ⅵ（60g）期。对Inx4进行进一步分析,发现Ⅱ期精巢内Inx4的m RNA主要分布于Sertoli细胞;在Ⅳ期精巢内主要分布于Sertoli细胞、精细胞和成熟精子中。不同层次研究结果共同表明Inx4在精子形成即精细胞变态时期发挥重要作用,在海洋无脊椎动物中尚属首次发现。3、对精子发生过程中,自噬、凋亡和雄性标记基因进行研究,发现自噬标记基因LC3/BECN1主要在精巢、脑、视叶、卵巢和性腺附属物（输精管、附缠卵腺）中表达。其中,在精巢中的表达量最高,显著高于卵巢。在脑、视叶和性腺附属物（输精管、附缠卵腺）中,LC3偏雄性表达,而BECN1偏雌性表达（p＜0.05）。精子发生过程中,LC3/BECN1表达量先升高后降低,于Ⅴ（41g）期达到表达峰值。荧光免疫组化结果表明,LC3在Ⅲ到Ⅴ期精巢内主要集中分布于不同时期的精细胞、成熟精子,以及少量Sertoli细胞中。对应Ⅳ-Ⅴ期精巢内出现大量自噬小体,表明自噬直接参与曼氏无针乌贼精子成熟。凋亡标记基因p53/Cas3在精巢中的变化规律与自噬相关基因基本一致,都在Ⅴ期达到峰值。雄性标记相关基因Sox4/Sox30于Ⅳ-Ⅴ期达到表达峰值,略提前于自噬/凋亡相关基因,总体变化趋势一致,符合生殖细胞的变化规律。4、建立了曼氏无针乌贼精巢体外自噬抑制模型,发现自噬抑制（CQ）导致Inx4和LC3的表达量在2 h、6 h时显著上升,而BECN1表达量显著下降。同时引起凋亡标记基因p53/Cas3在6 h显著升高。雄性标记基因Sox4/Sox30的表达量出现不同程度的升高,表达峰值主要出现在12 h和24 h,相对滞后于自噬和凋亡通路相关基因。5、建立了曼氏无针乌贼精巢体外自噬增效模型,发现自噬增效（RAPA）导致自噬过度激活,引起Inx4、LC3和BECN1显著升高,其中,Inx4和BECN1的变化趋势更为相近,均在2 h显著升高并达到表达峰值。自噬增效同时引起凋亡标记基因p53/Cas3表达量在低浓度组的2 h和高浓度组的12 h显著升高;Sox4和Sox30在2 h和12 h显著升高,并与LC3的变化趋势相近。6、建立了曼氏无针乌贼精巢Inx4敲降模型。确定12μM/L ds RNA、12 h为最佳的注射剂量和检测时间。Inx4敲降引起Inx2、Inx4、Inx8 A、Inx9 A均出现显著降低。自噬标记基因LC3/BECN1发生显著下降,表明Inx4与自噬通路存在密切关系。Inx4敲降同时引起p53/Cas3显著降低,反映凋亡通路也受到抑制。Sox30显著降低并在6和12μM/L ds RNA组降至最低,而Sox4表达量相对稳定,暗示了二者在响应Inx4变化和潜在功能上可能存在在一定差异,Inx4可能与Sox30的关系更为密切,且Inx4敲降对精细胞（Sox30）的影响要显著强于Sertoli细胞（Sox4）。综上,本论文的研究结果系统揭示了曼氏无针乌贼精子发生的组织学和细胞学规律,初步阐明了Inx4在精子发生过程中的自噬调控机制。研究结果丰富了海洋无脊椎动物性腺成熟相关理论,为深入探讨Inxs家族调控精子发生机制及其在生殖调控中的应用提供重要基础和理论支持,有助于推动这一珍贵东海物种的种质资源修复和保护工作。