木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,主要由纤维素（～50%）、半纤维素（～25%）和木质素（～25%）等组分构成。其中,半纤维素的主要成分是结构复杂且具有高度分支的木聚糖,往往存在于木质素和纤维素之间。木聚糖的有效降解在增加纤维素酶对纤维素的可及性,从而在提高木质纤维素的整体降解效率方面发挥着不可或缺的作用。在众多可降解木质纤维素的微生物中,丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）一直作为纤维素酶和半纤维素酶类的主要工业生产菌种,广泛应用于能源、食品、纺织和造纸等领域。近年来,人们不断致力于阐明里氏木霉中纤维素酶的诱导合成机理,以期进行理性的菌株改造,实现酶产量的有效提升。相比于对包括多种正负调控因子的纤维素酶合成调控网络的研究,人们对里氏木霉中以木聚糖酶为主要代表的半纤维素酶合成的调控机理研究却滞后很多,仅有少量研究报道。然而,里氏木霉中具有多种木聚糖酶编码基因,其表达调控也是一个极其复杂的过程,从开始感受环境信号到诱导木聚糖酶基因的表达,需要多种不同的蛋白因子参与。因此,对里氏木霉中木聚糖酶基因表达调控因子的鉴定及对其调控机制的解析不仅能够从分子水平更深入地了解木聚糖酶基因的表达调控机制,深化和丰富里氏木霉对木质纤维素整体协同降解调控网络的认识,还可以为提高里氏木霉木聚糖酶工业生产水平提供理论支持,因此本研究既具有重要的理论意义,也具有潜在的应用价值。基于以上立题依据,本论文对里氏木霉木聚糖酶基因的表达调控展开了系列研究,取得的主要研究成果如下:1.确定了 XYNⅡ是里氏木霉胞外发酵液中木聚糖酶活性的主要贡献者,且xyn2的缺失可促进xyn1的表达研究中构建了xyn1和xyn2的缺失突变株Δxyn1和Δxyn2,制备了 XYNⅠ和XYNⅡ的抗体,检测了两突变株的胞外木聚糖酶活性,发现每个抗体都能特异性地识别出相应的木聚糖酶,不存在交叉反应。通过检测Δxyn1和Δxyn2菌株的木聚糖酶活性、木聚糖酶基因转录水平以及木聚糖酶表达动力学,发现xyn1的缺失基本不影响XYNⅡ的表达分泌以及胞外发酵液中木聚糖酶的总活性;而在xyn2缺失后,虽然XYNⅠ的蛋白表达分泌量提升了两倍,但胞外发酵液中整体木聚糖酶的活性处于较低水平,由此证明XYNⅡ是里氏木霉胞外发酵液中木聚糖酶活性的主要贡献者,且xyn2的缺失促进了xyn1的表达。2.分离鉴定了一个新的影响里氏木霉木聚糖酶基因表达的调控因子--半乳糖醛酸转运蛋白GAT1通过分析比较野生型菌株QM9414在木聚糖和葡萄糖碳源下的转录组数据,发现半乳糖醛酸/葡萄糖醛酸转运蛋白GAT1在诱导碳源下的表达水平明显上调。通过分析木聚糖碳源下gat1缺失菌株和过表达菌株的表型,发现GAT1以xyn1为主要调控靶标阻遏木聚糖酶基因的表达;同时GAT1在果胶水解产物半乳糖醛酸培养下对果胶酶基因pec1、pec2以及xyn1的表达也发挥阻遏作用。此外,在木聚糖培养条件下额外添加葡萄糖醛酸并未对QM9414菌株中木聚糖酶的活性产生抑制作用,从而表明GAT1在木聚糖酶表达调控中的调控作用可能与其葡萄糖醛酸转运活性无关。通过对木聚糖诱导条件下Δgat1和QM9414的转录组数据分析,鉴定了一系列可能受GAT1调节的基因。其中,在Δgat1中转录因子Tr82512的表达上调最为明显。对Tr82512过表达菌株木聚糖酶活性分析发现,Tr82512的过表达促进了木聚糖酶的活性提升,说明gat1的缺失可能引起Tr82512的表达上调,继而提升了木聚糖酶的活性。综上所述,GAT1以xyn1为主要调控靶点抑制木聚糖酶基因的表达,其缺失可能通过上调转录因子基因Tr82512的转录水平来间接提升木聚糖酶的表达水平。3.鉴定了里氏木霉中一个新的木聚糖酶基因转录抑制因子XTR1,并证明其主要通过结合在xyn1启动子上参与木聚糖酶基因的表达调控。利用里氏木霉中木聚糖酶xyn1基因的启动子（Pxyn1）为“诱饵”,从木聚糖诱导条件下的里氏木霉cDNA文库中筛选获得了一个具有Cys2His2 DNA结合结构域的转录因子XTR1。细胞定位分析发现XTR1主要位于细胞核。XTR1的缺失和回补表型分析发现,XTR1以xyn1启动子作为主要调控靶标阻遏木聚糖酶基因的表达。通过体外凝胶迁移阻滞实验（EMSA）验证了 XTR1与xyn1启动子的特异性相互作用,并将其与启动子的结合区域缩短到105 bp（-321～-217）。最后,通过DNA足迹保护（DNase I footprinting）实验解析了 XTR1在xyn1启动子上的精准结合位点。综上所述,酵母单杂交筛选到的转录抑制因子XTR1,通过结合到xyn1的启动子上参与木聚糖酶基因的表达调控。4.构建了阻遏碳源条件下纤维素酶和木聚糖酶双高产的里氏木霉菌株。XYR1是里氏木霉中介导几乎所有纤维素酶和半纤维素酶基因表达的关键转录激活因子。XYR1的过表达（OExyr1）使纤维素酶基因在葡萄糖阻遏碳源下组成型高水平表达,但无法同样激活木聚糖酶基因。为进一步提升OExyr1菌株的木聚糖酶活性,在OExyr1菌株中敲除了可以调控xyn1、xyn2和xyn5的木聚糖酶阻遏因子Sx1R,构建了OExyr1-Δsxlr菌株。通过分析OExyr1-Δsxlr菌株的酶活表型发现,sxlr的缺失明显提升了菌株在Avicel或葡萄糖条件下的木聚糖酶的活性和β-葡萄糖苷酶的活性。之后通过染色质免疫共沉淀（ChIP）实验发现,OExyr1-Asxlr菌株中过表达的XYR1可显著提升其在xyn2启动子上的占据水平,并由此提升xyn2表达从而提高了胞外木聚糖酶的活性。进一步通过糖化实验发现,葡萄糖条件下的OExyr1-Δsxlr菌株的发酵液对麸皮和玉米皮两种天然底物的糖化能力优于OExyr1菌株。综上所述,通过XYR1的过表达和SxlR的缺失得到了在可溶性阻遏碳源条件下同时高产纤维素酶和木聚糖酶的菌株,提升了对天然底物的糖化效率,具有良好的工业应用潜力。