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Bt基因是目前转基因食品中使用最广泛且最有效的一种杀虫基因,并且被广泛应用于基因工程中。目前所发现的Bt基因有130多种,而且新的Bt基因还在不断的被发现和鉴定。Bt基因主要包括晶体蛋白家族基因(Cry)和细胞溶解蛋白基因(Cyt)。在进行转基因食品研究、开发和商业化的同时,建立恰当的方法对转基因食品中转基因成分进行快速鉴定与检测,能够促进农业转基因生物安全管理,保障人和动物以及微生物的安全,同时能够保护生态环境,促进农业转基因生物技术的进一步研究。本文以目前研究最多的抗虫Cry1Ac基因表达的Cry1Ac蛋白为检测目标,在提取获得高纯度抗原后制备高度特异性的多克隆抗体、单克隆抗体和HRP酶标抗体的基础上,比较了三种ELISA方法的灵敏度和线性检测范围,初步建立起了能够快速检测Cry1Ac蛋白的ELISA检测试剂盒。主要试验结果如下：1. CrylAc蛋白纯度和浓度分析通过SDS-PAGE对抗原蛋白Cry1Ac的纯度分析结果表明,所获得的抗原蛋白纯度高,分子量在66.4KDa左右,达到了免疫所需要的纯度与分子量标准；采用BCA试剂盒测定蛋白浓度的结果表明,Cry1Ac蛋白浓度为1.31mg/mL,达到了免疫所需的抗原浓度要求。2.多抗血清纯化及多克隆抗体制备将Cry1Ac蛋白与等量弗氏完全佐剂混合后采用背部皮下多点注射(免疫两只兔子编号3359、3360),四次免疫后,3360号兔子血清效价高于10000,说明3360号兔子血清对免疫抗原具有良好的亲和性,且其免疫效果明显较3359号兔子好,因此对3360号兔子在进行加强免疫之后取全血、并通过Sepharose CL-4B Protein A柱对该兔子的多抗进行分离纯化。利用SDS-PAGE技术对纯化后的多克隆抗体进行纯度分析的结果表明,分离纯化后的多克隆抗体具有极高纯度(>90%),几乎没有其他杂蛋白。3.杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备进一步通过免疫三只兔子(编号82、83、84)制备兔单克隆抗体的结果表明：所选择的编号为84号的免疫效果最好。取该编号兔的脾融合17天后,共筛选出92个阳性多克隆。然后将这92个阳性克隆转移到24孔培养板上培养一周,筛选出阳性克隆子33个和双阳性克隆子14个,其中三个克隆子(编号zju-11-18, zju-11-71,zju-11-91)用于质粒重组(亚克隆),三个克隆子(编号zju-11-41, zju-11-47, zju-11-50)作为重组备份,八个克隆子(编号zju-11-24, zju-11-28, zju-11-38,zju-11-61, zju-11-65, zju-11-70, zju-11-82, zju-11-84)用于冻存。最终选取一个sub克隆子(zju-11-71)进行单克隆抗体生产。制备的单克隆抗体经Sepharose CL-4B Protein A柱分离纯化后,用PBS溶液溶解,其终浓度为1.78mg/mL。SDS-PAGE纯度分析结果表明,该溶液中没有其他杂蛋白。所获得的单克隆抗体的效价达到32000倍,且其对目标抗原的亲和常数为Ka=2.69×109M-1。该抗体与Cry1Ab蛋白无明显交叉反应,仅当Cry1c蛋白包被浓度为1000ng/mL时有微量交叉反应。4.抗体辣根过氧化物酶(peroxidase horseradish, HRP)标记及其工作浓度的确定采用过改良过碘酸钠法将抗体和HRP酶进行偶联,结果表明抗体与HRP成功偶联,多抗-HRP工作浓度为1：200,单抗-HRP工作浓度为1：320。5. ELISA检测方法的对比试验建立了三种ELISA方法,分别为间接ELISA,单抗-抗原-酶标多抗夹心ELISA和多抗-抗原-酶标单抗夹心ELISA,分析对比三者的灵敏度、线性检测范围确定比较理想的ELISA.其中间接ELISA方法的最低检测限为50ng/mL,其线性检测范围为100-400ng/mL;单抗-抗原-酶标多抗夹心ELISA其最低检测限为0.24ng/mL,其线性检测范围为0.975～62.5ng/mL;多抗-抗原-酶标单抗夹心ELISA其最低检测限为1.95ng/mL,其线性检测范围为3.9～62.5ng/mL。单抗-抗原-酶标多抗的检测限浓度最低,线性检测范围最广,因此单抗-抗原-酶标多抗法是比较理想的一种ELISA方法。6. ELISA检测方法的适用性从交叉反应、回收率试验、实物样品检测等方面来对所获得的ELISA方法的特异性、精确度和准确性进行了分析。结果表明：ELISA检测体系中所使用的兔抗体系与其他Bt蛋白(如Cry1Ab, Cry1c蛋白)无明显交叉反应。采用外标法检测水稻叶片,ELISA分析结果显示其回收率可达89.2～121.92%,且其平均回收率可达103.35%。对转基因样品的检测结果显示,阳性样品检测结果为阳性,阴性样品检测结果为阴性,因此该ELISA方法能够有效地识别转基因样品中的Cry1Ac蛋白。上述试验表明,研究所开发的ELISA检测体系能够满足对Cry1AC蛋白的检测要求,具有潜在的应用前景。