五氯酚（Pentachlorophenol，缩写为PCP，分子式为C<,6>Cl<,5>OH）是一种典型的持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs），作为一种高效、廉价的杀虫剂、防腐剂及除草剂，在世界范围内广泛使用。PCP的生态毒理与生态风险研究仍有许多未知领域。作为一种诱变剂或辅诱变剂，PCP可能在遗传学上具有潜在危险性。由于PCP在水环境中广泛存在，因此评价该类化合物对水生生物的遗传毒性效应具有更重要意义。科学家们从不同层次上对五氯酚是否诱导突变进行了检测，但都未得到确证，因此，五氯酚一直被认为是一种有争议的致突变物质。 与肿瘤形成关系密切的抑癌基因（p53基因），是重要的功能基因，也是环境遗传毒物的重要攻击靶。而点突变在肿瘤的发生和发展过程中常起到决定性作用，因此检测p53基因的点突变，对于PCP遗传毒理学分子机制研究具有重要的理论意义。 本论文采用国内外标准的生态毒理学试验动物斑马鱼为模式动物，以PCP为研究对象，以p53基因为目标基因，开展了以下工作：1）测定了PCP对斑马鱼的急性毒性；2）分析了斑马鱼p53基因的结构及序列保守性；3）建立巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（nested PCR-RFIP）方法，研究五氯酚诱导斑马鱼p53基因的点突变；4）建立克隆测序的方法，研究五氯酚诱导斑马鱼p53基因的点突变；5）探索变性高效液相色谱（Denaturing High-Performance Liquid Chromatography，DHPLC）方法在p53基因点突变检测中的可行性。研究的主要目的是从分子水平上揭示低浓度PCP的致点突变性，探索水环境中有机污染物诱导未知点突变的检测技术。其主要研究结果如下： （1）PCP对斑马鱼的急性毒性研究表明：五氯酚对斑马鱼24 hLC<,50>值为0.196mg／L；48 h、72 h和96 h LC<,50>值均为0.130 mg／L。从急性毒性来看，毒性高于一般氯代化合物和一般农药，根据海洋污染问题专家联合组织推荐的标准，五氯酚属于水环境极毒物质。 （2）斑马鱼p53基因结构分析结果表明：斑马鱼p53基因由11个外显子和10个内含子组成，外显子1和部分外显子11不参与编码蛋白质。其cDNA 核苷酸序列共1696 bp，包含一个1122 bp的开放阅读框（Open ReadingFrame，ORF）（44 bp-1165 bp），这个ORF编码373个氨基酸。另外在3’端有534 bp是非翻译区（3’-UTR），5’端同样也存在43 bp的非翻译区（5’-UTR）；12种脊椎动物p53氨基酸序列的保守性分析结果表明，在一些特殊的区域，12种氨基酸序列表现出了很高的保守性。这些区域和p53的抑癌功能也密切相关。同时在C端的四聚体区也表现出了一定的保守性，这个区域和p53单体的四聚体化密切相关。 （3）通过对包含斑马鱼p53基因外显子2,3,4及其间内含子2,3的目标片段，进行nested PCR-RFLP分析，结果表明：20条经PCP染毒的斑马鱼的在此目标片段的Bcl I、Nco I、Nsi I、Sac I、Sca I、Rsa I等6种限制性内切酶位点上均未检测出点突变。nested PCR-RFLP分析的灵敏度受到电泳检测方法的限制，难以对体细胞低频点突变进行检测。 （4）通过对包含斑马鱼p53基因外显子7的173 bp的目标片段进行克隆测序分析，结果表明：PCP可以诱导斑马鱼p53基因外显子7的点突变；在所发生的点突变中，A→G转换的频率明显高于其他类型；肝脏发生点突变的频率高于肌肉；根据本方法计算出PCP诱导p53基因外显子7的碱基突变率，0.5μg/L组为1.5‰；5μg/L组为1.5‰；50μg/L组为3.0‰。克隆测序分析方法是一种精确和可信的点突变检测方法。 （5）DHPLC在p53基因点突变检测中的可行性研究结果表明：通过克隆测序方法检测出的两个样本的已知点突变，用DHPLC同样可以检出。对斑马鱼p53基因外显子7 DHPLC检测的最优化检测柱温为60℃，其特异性很好，敏感性>99％，检测限<1％。初步研究表明，DHPLC可以用来检测PCP诱导的斑马鱼p53基因点突变。