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背景NK/T细胞淋巴瘤（NK/T cell lymphoma,NKTCL）是一种较为罕见的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）,在亚洲和南美人群中发病率较高。NKTCL呈高度侵袭性,患者5年生存率低,复发率高,常规化疗及放疗仍是现今NKTCL的主要治疗方式,但是晚期NKTCL患者疾病进展更加迅速,致死率极高。因此,进一步深入研究NKTCL恶性进展的分子机制,寻找更有效的靶向治疗途径,对提高NKTCL的疗效、改善患者的生存具有重要意义。G蛋白参与细胞的信号转导,包含α,β和γ三个亚单位,其中α亚单位结合并水解GTP,与β和γ亚单位共同组成异源三聚体。G蛋白功能亚单位的激活性突变在恶性肿瘤的进展中发挥重要作用。课题组前期通过对127例NKTCL患者进行全外显子组测序（whole-exome sequencing）联合靶向深度测序（Targeted deep sequencing）,在8.7%（11/127）的患者中鉴定出GNAQ T96S这一频发体细胞突变。T96S突变是淋巴造血系统肿瘤中最常见的GNAQ（编码Gαq蛋白）热点突变。在NKTCL中,野生型GNAQ通过促进肿瘤细胞凋亡发挥抑癌作用;而发生T96S突变的GNAQ诱导肿瘤细胞凋亡的能力显著减弱。在NKTCL患者中,GNAQ T96S突变体的表达与更差的预后显著相关。但GNAQ T96S突变是如何抑制NKTCL肿瘤细胞的凋亡,进而促进NKTCL的恶性进展,其分子机制仍然有待进一步阐释。课题组前期通过蛋白免疫沉淀联合质谱分析,发现膜联蛋白A2（Annexin A2,ANXA2）可以作为分子伴侣与GNAQ T96S突变体直接结合。ANXA2是一种多功能蛋白,在多种肿瘤中表达上调,尤其在高侵袭性、高复发率的肿瘤中上调更为明显。ANXA2在Tyr24位点的磷酸化（p Y24-ANXA2）与ANXA2蛋白的细胞定位及功能特点密切相关。由此我们猜想:GNAQ T96S突变是否通过与ANXA2相互作用,影响了ANXA2的磷酸化水平,进而影响肿瘤细胞的凋亡,导致了肿瘤的恶性进展。TAT肽是最常使用的细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）,可以将与之交联的多肽或蛋白质分子转运至细胞内。在本课题中,我们设计了一种TAT-T96S肽,通过化学交联法将TAT蛋白与GNAQ T96S突变体的同源序列融合为TAT-T96S肽。TAT-T96S肽可能通过与GNAQ T96S竞争性结合ANXA2蛋白,而干扰GNAQ T96S突变与ANXA2的结合。通过在细胞水平和整体水平检测TAT-T96S肽的干扰效率,我们分析了GNAQ T96S突变作为NKTCL患者治疗靶点的应用潜力。方法1.GNAQ T96S突变促进ANXA2的磷酸化1.1在稳定过表达Flag-wild-type GNAQ及Flag-T96S GNAQ的NK/T细胞淋巴瘤YT细胞系中,使用Flag抗体进行蛋白免疫沉淀,联合Western Blot检测实验组及对照组中GNAQ与ANXA2的结合情况。1.2在稳定过表达wild-type GNAQ、Flag-T96S GNAQ及同时表达wild-type GNAQ、Flag-T96S GNAQ的NK/T细胞淋巴瘤YT和KHYG1细胞系中,通过Western Blot实验检测GNAQ T96S突变对ANXA2磷酸化水平的影响。1.3收集NKTCL患者组织标本,其中5例表达野生型GNAQ,另有5例表达T96S突变型GNAQ,使用免疫组织化学技术检测组织水平上ANXA2在酪氨酸24位点（p Y24-ANXA2）的磷酸化水平。2.ANXA2的磷酸化抑制NKTCL肿瘤细胞的凋亡在稳定过表达wild-type GNAQ及同时表达wild-type GNAQ和ANXA2 Y24D（模拟ANXA2 Tyr24磷酸化激活）的YT和KHYG1细胞系中,使用流式细胞术,检测各组细胞的凋亡水平;在稳定过表达T96S突变型GNAQ及同时表达T96S GNAQ和ANXA2 Y24F（模拟ANXA2 Tyr24磷酸化失活）的YT和KHYG1细胞系中,使用流式细胞术,检测各组细胞的凋亡水平。3.GNAQ T96S招募Src激酶以磷酸化ANXA23.1在稳定过表达Flag-wild-type GNAQ及Flag-T96S GNAQ的YT细胞中,使用Flag抗体进行蛋白免疫共沉淀,检测GNAQ与ANXA2及Src激酶的结合情况。3.2使用Src激酶抑制剂Saracatinib处理稳定过表达wild-type GNAQ、T96S GNAQ的YT细胞,检测ANXA2在酪氨酸24位点（p Y24-ANXA2）磷酸化水平的变化。4.TAT-T96S肽通过与GNAQ T96S突变体竞争性结合ANXA2诱导NKTCL肿瘤细胞凋亡4.1构建包含不同长度氨基酸的GNAQ T96S截断体,使用蛋白免疫共沉淀联合Western Blot实验来进一步确认GNAQ T96S与ANXA2蛋白的结合区域。4.2应用不同浓度的TAT-T96S肽处理稳定表达Flag-T96S GNAQ的YT细胞,使用Flag标签抗体进行蛋白免疫共沉淀,联合Western Blot实验检测不同浓度TAT-T96S肽影响GNAQ与ANXA2结合的效率。4.3应用TAT-T96S肽处理稳定表达wild-type GNAQ及T96S GNAQ的YT细胞,使用流式细胞术检测不同实验组细胞的凋亡水平。4.4在表达wild-type GNAQ及Flag-T96S GNAQ的YT细胞中,应用TAT-T96S肽或对照溶剂处理,通过Western Blot实验检测ANXA2、ERK、AKT等蛋白及其磷酸化水平的变化。5.TAT-T96S肽抑制GNAQ T96S突变的NKTCL异种移植瘤的生长构建表达野生型GNAQ及T96S突变型GNAQ的NKTCL肿瘤异种移植模型,并通过尾静脉注射TAT-T96S肽或对照溶剂,在实验终止时检测瘤体大小和重量。结果1.GNAQ T96S突变促进了ANXA2的磷酸化1.1与野生型GNAQ相比,T96S突变型GNAQ可以与更多的ANXA2蛋白结合。1.2在YT和KHYG1细胞系中,GNAQ T96S突变促进了ANXA2在Tyr24位点的磷酸化。1.3在NKTCL组织切片中,与表达野生型GNAQ的对照组相比,GNAQ T96S突变的组织标本中,p Y24-ANXA2的水平显著升高。2.ANXA2的磷酸化抑制NKTCL肿瘤细胞的凋亡与空白对照组相比,野生型GNAQ可以显著促进YT和KHYG1细胞的凋亡水平,但其促凋亡效应可以被高度磷酸化激活（ANXA2 Y24D）的ANXA2逆转。而T96S突变型GNAQ对细胞的凋亡水平几乎没有影响,但在GNAQ T96S和模拟ANXA2磷酸化失活（ANXA2 Y24F）的实验组,细胞的凋亡水平显著升高。3.GNAQ T96S招募Src激酶以磷酸化ANXA23.1与野生型GNAQ相比,T96S突变型GNAQ可以与更多的Src及ANXA2蛋白结合形成复合体。3.2 Src激酶抑制剂Saracatinib处理不影响ANXA2总蛋白的水平,但却显著抑制T96S突变的YT细胞中ANXA2酪氨酸24位点（p Y24-ANXA2）的磷酸化水平。4.TAT-T96S肽通过与GNAQ T96S突变体竞争性结合ANXA2诱导NKTCL肿瘤细胞凋亡4.1 ANXA2蛋白与GNAQ T96S突变体的结合区域位于GNAQ T96S的螺旋结构域。4.2 TAT-T96S肽可以竞争性结合ANXA2蛋白,干扰GNAQ与ANXA2蛋白的相互作用,且随着GNAQ T96S肽浓度的增加,干扰效应亦逐渐增强。4.3 TAT-T96S肽可以显著提高发生GNAQ T96S突变的YT细胞的凋亡水平。4.4 GNAQ T96S突变显著促进了YT细胞中AKT,ERK及ANXA2磷酸化水平升高,而TAT-T96S肽处理可以逆转这种效应。5.TAT-T96S肽抑制GNAQ T96S突变的NKTCL异种移植瘤的生长在发生GNAQ T96S突变的小鼠NKTCL异种移植瘤模型中,与注射对照溶剂的组相比,TAT-T96S肽处理显著抑制了移植瘤的重量和大小。结论1.GNAQ T96S突变体招募Src激酶与ANXA2组装成复合体,并通过Src激酶磷酸化ANXA2,从而抑制NKTCL肿瘤细胞的凋亡。2.当TAT-T96S肽进入肿瘤细胞后,它通过与GNAQ T96S竞争性结合ANXA2而干扰了GNAQ T96S/Src/ANXA2蛋白复合体的形成,进而诱导了细胞凋亡。