养兔业的健康发展受到兔瘟和兔球虫病的严重威胁。兔瘟组织灭活疫苗潜在的生物安全隐患、仔兔的疫苗免疫持续期短,以及慢性感染家兔的持续排毒是兔瘟防控需解决的重要问题。同时,兔球虫具有良好的免疫原性,一次免疫即可激发较强的黏膜免疫应答。近年来本课题组一直进行以转基因艾美耳球虫为载体的活疫苗研究,以期为生产提供更加安全、便捷的免疫策略。因此,本研究以兔球虫为载体重组表达兔瘟病毒衣壳蛋白VP60-P2亚域,评估转基因兔球虫作为重组疫苗载体的可行性,为兔瘟和兔球虫病新型疫苗的研发提供思路。我们首先利用染色体步移的方法获取了大型艾美耳球虫proflin基因的调控序列,并通过体外转染证实了其启动外源基因在兔球虫表达的能力。但我们未能使用该调控序列实现兔球虫的稳定转染,故此我们使用柔嫩艾美耳球虫保守的组蛋白4(His4)基因作为调控序列进行转染,成功获得了一株表达黄色、红色荧光蛋白的转基因大型艾美耳球虫(EmagER)。我们观察到荧光蛋白在球虫生活史的各个阶段均有表达;生物学特性对比试验结果表明,EmagER与原始虫株具有相似的繁殖力和免疫原性。为检测转基因球虫激发宿主免疫应答的能力,我们针对当前家兔免疫学和疫苗学研究工具比较缺乏的现状,建立了家兔细胞免疫检测平台。我们利用qPCR方法对EmagER接种后家兔免疫应答相关的细胞因子转录水平进行了检测。结果显示EmaER免疫能够有效激发家兔肠道部位(肠系膜淋巴结,mesenteric lymphnodes,MLN)的淋巴细胞产生针对外源蛋白的Th-1型细胞免疫应答。此外,我们还制备了针对家兔CD3、CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α等免疫分子的单克隆抗体,通过免疫印迹和流式细胞术验证,获得了可用于流式细胞术的CD4和TNF-α单克隆抗体。为家兔免疫学研究提供了有力的工具。进而,我们构建了表达兔瘟病毒衣壳蛋白VP60-P2亚域的转基因大型艾美耳球虫(EmagE-VP60)。我们发现,在虫体的裂殖生殖时期,VP60-P2在细胞膜表面和胞浆内同时表达,能够被宿主免疫系统识别。EmagE-VP60免疫家兔后,针对VP60-P2蛋白的抗体水平和外周血单个核细胞特异性CD8+TNF-α+细胞比例较野生.虫株免疫组稍有上升但无显著差异;肠道派尔氏结(payer’s patches)、MLN淋巴细胞经VP60-P2刺激后,Th-1型细胞因子相对转录水平较野生虫株免疫组显著上升。这些结果表明,EmagE-VP60表达的VP60-P2能够在肠道部位激发宿主产生针对外源蛋白的特异性免疫应答。综上所述,本研究首次建立了兔艾美耳球虫的转染平台,构建了表达兔瘟病毒抗原的转基因大型艾美耳球虫。转基因球虫免疫后能够激发宿主在肠道部位产生针对外源蛋白的特异性免疫应答,为今后的转基因兔球虫活载体疫苗的免疫机制研究和应用研发提供了良好的基础。