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目的 设计和克隆一种能特异性切割人乳头瘤病毒（HPV）16型E6基因mRNA的核酶，研究该核酶对HPV16阳性的宫颈癌细胞株的恶性表型、免疫学特性、凋亡表型和基因调控的影响，以探讨HPV的致癌机制和治疗方法。 方法 1、采用计算机软件，针对HPV16E6基因设计锤头状核酶。2、合成核酶的基因，克隆于原核表达质粒中，进行体外切割实验以鉴定核酶的活性。3、将抗HPV16E6核酶装入真核表达质粒，以脂质体法将核酶与空载体质粒分别导入CaSKi细胞，分别命名为CaSKi-R和CaSKi-P细胞。点杂交检测核酶在细胞中的表达，northern杂交检测三种细胞中E6基因的表达。4、测定三种细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成率，并以皮下接种法检测细胞在裸鼠体内的成瘤能力。流式细胞仪检测三种细胞中HPV16E6、PCNA、C-erbB-2蛋白的表达。5、流式细胞仪分析三种细胞的DNA和凋亡率，检测凋亡相关蛋白c-myc、bcl-2、p53、Fas等的表达。6、流式细胞仪分析三种细胞的表面抗原HLA-1、HLA-2、B7-1和B7-2的表达，诱导制备NK、LAK、CD3AK和肿瘤细胞激活的LAK细胞，检测各种免疫细胞对CaSKi-R、CaSKi-P、CaSKi细胞的杀伤效应。 结果 1、选择E6基因的170位为切割位点，设计锤头状的核酶，两侧的结合臂各为9个碱基。2、体外切割实验证明抗HPV16E6核酶具备切割活性，在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6 mRNA片段。3、脂质体转染后，点杂交证实核酶能在CaSKi-R细胞中稳定表达，northern杂交证实CaSki-R中E6 mRNA的量比CaSKi-P、CaSKi明显降低。4、CaSKi-P、CaSKi细胞生长速率相近，CaSKi-R细胞的生长速度明显降低。与CaSKi细胞相比，CaSKi-R细胞表达HPV16E6、PCNA、C-ethB-2蛋白明显减少，软琼脂克隆形成率显著降低，在裸鼠体内的致癌能力下降。而CaSKi-P细胞无此改变。5、与CaSKi细胞相比，CaSki-R细胞的凋 亡率明显增高，出现凋亡峰，S期、GZM期细胞百分率下降。CaSKi－R 细胞表达HPV 6E6、C－myc、hcf上蛋白明显减少，而表达P53明显增 高：两者中FSS蛋白的表达相近。＊ashF细胞中表达各种蛋白与＊拈o 细胞无显著差异。6、CaSKi和CaSKIP细胞中HLA上、B7J、B7刁抗 原表达都很低，两者无显著差别。CaSKi－R中 HLA－2、B7－l、B7－2表 达均明显升高。三种细胞中HLA1表达率都很高。NK、LAK、CD3AK＿细胞对 Caski－R细胞杀伤率显著高于 CaSXi细胞，CaSKi、CaSXi－R分可 别激活的LAK细胞（称Ca－LAK和CaR－LAK）杀伤活性与LAK细胞 无明显差别，对CaSXi－R的杀伤活性高于CaSKi细胞。而各种兔疫细 胞对CaSXiP细胞的杀伤率与CaSXi细胞无显著差异。 结论 所获得的抗 HPV 6E6核酶能特异性切割 HPV 6E6 InRNA。 该核酶的导入不但能部分逆转 HPV阳性的宫颈癌细胞株 CaSKi的恶 性表型，而且使Caski细胞易于被机体免疫系统识别杀伤，难于免疫逃 避，并能诱导Caski细胞发生凋亡。其原因可能在于病毒癌基因E6表 达的降低，以及由此而引起的细胞内蛋白表达水平的改变，包括PCNA、 C－erbB－2、HLA－2、B7－l、B7－2、P53表达的上调，c－myc、bclZ表达 的下调。抗 HPV 6E6核酶不能提高 Caski细胞的免疫原性。