目的：　　 精子的发生是一个复杂的细胞分化过程,分为3个不同的阶段:有丝分裂期、减数分裂期和单倍体期。在这个过程中,精原细胞经历了许多复杂而精密协调的分子事件及细胞事件,通过增殖和分化形成功能特异的雄性配子--精子。睾丸组织在精子发生过程中乃至哺乳动物个体形成过程中显示了很强的转录活性,转录因子在特殊的细胞事件中调控基因的表达。Fank1基因就是一个睾丸特异表达基因,编码一种核蛋白,在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达,相关实验表明该蛋白为睾丸组织特异转录因子。本研究通过构建GST-FANK1融合表达载体,诱导表达FANK1蛋白,并用靶序列循环扩增(CAST)实验确定FANK1的DNA结合序列,为进一步研究FANK1调节的靶基因奠定基础。　　 方法　　 通过PCR的方法,以pdsRED-Fank1质粒为模板,扩增小鼠FANK1蛋白中的FnⅢ结构域DNA序列,将目的片段插入原核表达载体pGEX-4T-2的GST基因下游,转化E.coli BL21(DE3)细菌,通过内切酶鉴定及DNA测序筛选出正确的重组质粒。采用不同温度,0.5mM IPTG对菌体进行诱导表达,分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h收集菌体,经SDS-PAGE电泳分析找到最适宜诱导温度和时间,并且用不同浓度的IPTG(终浓度为0.5mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM)进行诱导表达,优化IPTG的诱导浓度。按优化条件诱导重组表达质粒,经裂解、透析复性得到溶解蛋白,该蛋白经过GST Bind Resin亲和层析,获取纯化的GST-FANK1融合蛋白并通过Western Blot鉴定。获得FANK1蛋白用于CAST实验,通过对测序结果的比对来确定蛋白质的DNA结合序列。　　 结果　　 1、Fank1基因的PCR扩增产物经酶切后,与原核表达载体pGEX-4T-2连接,经电泳、酶切及DNA测序鉴定表明目的基因成功插入到载体中。　　 2、鉴定正确的重组质粒经30℃,0.5mM IPTG诱导5h表达量最高,表达的GST-FANK1融合蛋白分子量约为43kDa。　　 3、FANK1蛋白以包涵体形式存在,通过裂解包涵体,经透析复性,GST BindResin亲和层析,纯化得到GST-FANK1融合蛋白。　　 4、CAST 实验通过测序获得的44个结果比对,DNA序列AAAAAG出现百分率最高。　　 结论　　 1、成功构建了小鼠FANK1蛋白FnⅢ结构域的重组原核表达载体pGEX-FnⅢ。以IPTG诱导表达,并纯化出该重组蛋白,为进一步研究转录因子的作用奠定了基础。　　 2、DNA序列AAAAAG可能为FANK1转录因子特异性结合序列。