论文部分内容阅读
体色是彰显观赏生物商品价值的重要指标，白条双锯鱼(Amphiprion frenatus)作为目前较受欢迎的观赏鱼品种之一，其体色发育过程存在十分明显的转色阶段。本研究以白条双锯鱼发育过程中特征鲜明的3个阶段为样本材料，基于高通量转录组测序，筛选出差异表达的mRNA和miRNA对其进行功能注释和相互作用预测，并通过荧光定量PCR对测序结果进行验证。同时，以4月龄幼鱼为对象，研究天然虾青素对其色素沉积和相关基因表达的影响。结果如下：
(1)转录组测序共组装获得99858条Unigenes，得到5464个差异表达基因，包括4062个下调基因和1402个上调基因。其中载脂蛋白基因在高表达基因中所占比例最大，该基因可通过调节脂质代谢影响机体脂溶性色素沉着。4424个基因被注释到GO数据库，共参与42个GO分类，其中差异基因归类到生物过程的基因最多，分子功能的基因最少。通过KEGG注释的基因共参与到286个代谢通路，其中有45个显著富集通路。Top20通路中与色素沉着相关的途径主要包括糖酵解、脂肪酸降解、视黄醇代谢、MAPK和cAMP-PKA通路。
(2)分别以1周龄、4月龄和12月龄白条双锯鱼的脑、皮肤、肌肉组织为样本材料，对候选体色调控相关的基因进行荧光定量PCR验证，共筛选得到小眼畸形相关转录因子(MITF)等9个与测序结果相符的基因。其中MITF和TYR基因的表达趋势相同，脑和皮肤组织中均有下调趋势，但试验组与对照组差异不显著(P＞0.05)，肌肉组织中12月龄组极显著上调(P＜0.01)，4月龄组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。SOX10和PAX3基因于皮肤组织中均显著下调表达(P＜0.05)，PAX3基因在肌肉组织中极显著上调表达，12月龄组的表达量极显著高于对照组和4月龄组(P＜0.01)，与MITF基因在皮肤和肌肉组织中的表达情况类似，表明在皮肤组织中这两个基因可能激活了MITF基因的表达。Slc7a基因于皮肤组织中上调表达，12月龄组的表达量显著高于对照组和4月龄组(P＜0.05)。SFRP5基因于12月龄组皮肤组织中的表达量极显著低于4月龄组(P＜0.01)。其余基因表达情况未见与体色调控相关的趋势。EDNRB基因于皮肤和脑组织中均无差异表达(P＞0.05)，仅4月龄肌肉组织中表达量显著低于对照组(P＜0.05)，未见与MITF基因相关联的表达趋势。MPV17基因仅于肌肉组织中有差异表达，12月龄组表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。ATF2基因于皮肤组织中下调表达(P＜0.01)，肌肉组织中的表达量先下降后升高，12月龄组的表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。
(3)获得已知miRNA成熟体(mature)194个，前体(hairpin)338个；预测到novelmiRNA成熟体91个，前体115个；差异miRNA中上调基因23个、下调基因24个。对候选基因进行荧光定量PCR验证，得到miR-221-5p等6个与测序结果相符的基因。其中miR-221-5p基因于12月龄肌肉组织中的表达量极显著低于4月龄组(P＜0.01)，与该组织中TYR基因表达结果相反，可视为其存在潜在结合位点。靶基因预测结果显示，多个差异表达的miRNA与色素沉着相关基因可能存在结合位点。其中miR-34a、novel_37、novel_39、novel_101、novel_4、novel_40上调表达，与MITF、SOX10、ATF2等存在潜在结合位点。
(4)虾青素对白条双锯鱼体表Lab值具有显著影响，可使红度(a*)值显著升高，亮度值显著减弱(P＜0.05)。随饲料虾青素添加量的升高，体表黑色素细胞密度显著升高(P＜0.05)、体积增大、树突状分支增多。鳍条虾青素含量与饲料虾青素添加量呈正相关。添加量150mg/kg之前，皮肤虾青素含量随饲料虾青素添加量的升高而显著升高(P＜0.05)。各组肌肉组织中的虾青素含量无显著性差异(P＞0.05)。添加量150、200mg/kg两组的皮肤红度值(a*)和虾青素含量无显著性差异(P＞0.05)，投喂150mg/kg饲料即可达到最佳红度(a*)值和皮肤最高虾青素蓄积量。添加量50mg/kg组，鳍条叶黄素含量显著高于其他组(P＜0.05)，其余组织各组叶黄素含量均无显著性差异(P＞0.05)。MITF基因在皮肤中下调表达(P＜0.05)，脑和肌肉中的表达量均呈先升高后降低趋势，3组和2组分别为该两种组织的表达量最高点，极显著高于对照组(P＜0.01)。TYR基因在肌肉组织中极显著上调表达(P＜0.01)，在除第4组外的皮肤和脑组织中显著上调表达(P＜0.05)。SOX10基因在皮肤中下调表达，肌肉中除第4组外均上调表达，脑组织中2、3组上调表达，4、5组下调表达(P＜0.01)。
(1)转录组测序共组装获得99858条Unigenes，得到5464个差异表达基因，包括4062个下调基因和1402个上调基因。其中载脂蛋白基因在高表达基因中所占比例最大，该基因可通过调节脂质代谢影响机体脂溶性色素沉着。4424个基因被注释到GO数据库，共参与42个GO分类，其中差异基因归类到生物过程的基因最多，分子功能的基因最少。通过KEGG注释的基因共参与到286个代谢通路，其中有45个显著富集通路。Top20通路中与色素沉着相关的途径主要包括糖酵解、脂肪酸降解、视黄醇代谢、MAPK和cAMP-PKA通路。
(2)分别以1周龄、4月龄和12月龄白条双锯鱼的脑、皮肤、肌肉组织为样本材料，对候选体色调控相关的基因进行荧光定量PCR验证，共筛选得到小眼畸形相关转录因子(MITF)等9个与测序结果相符的基因。其中MITF和TYR基因的表达趋势相同，脑和皮肤组织中均有下调趋势，但试验组与对照组差异不显著(P＞0.05)，肌肉组织中12月龄组极显著上调(P＜0.01)，4月龄组与对照组无显著性差异(P＞0.05)。SOX10和PAX3基因于皮肤组织中均显著下调表达(P＜0.05)，PAX3基因在肌肉组织中极显著上调表达，12月龄组的表达量极显著高于对照组和4月龄组(P＜0.01)，与MITF基因在皮肤和肌肉组织中的表达情况类似，表明在皮肤组织中这两个基因可能激活了MITF基因的表达。Slc7a基因于皮肤组织中上调表达，12月龄组的表达量显著高于对照组和4月龄组(P＜0.05)。SFRP5基因于12月龄组皮肤组织中的表达量极显著低于4月龄组(P＜0.01)。其余基因表达情况未见与体色调控相关的趋势。EDNRB基因于皮肤和脑组织中均无差异表达(P＞0.05)，仅4月龄肌肉组织中表达量显著低于对照组(P＜0.05)，未见与MITF基因相关联的表达趋势。MPV17基因仅于肌肉组织中有差异表达，12月龄组表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。ATF2基因于皮肤组织中下调表达(P＜0.01)，肌肉组织中的表达量先下降后升高，12月龄组的表达量极显著高于对照组(P＜0.01)。
(3)获得已知miRNA成熟体(mature)194个，前体(hairpin)338个；预测到novelmiRNA成熟体91个，前体115个；差异miRNA中上调基因23个、下调基因24个。对候选基因进行荧光定量PCR验证，得到miR-221-5p等6个与测序结果相符的基因。其中miR-221-5p基因于12月龄肌肉组织中的表达量极显著低于4月龄组(P＜0.01)，与该组织中TYR基因表达结果相反，可视为其存在潜在结合位点。靶基因预测结果显示，多个差异表达的miRNA与色素沉着相关基因可能存在结合位点。其中miR-34a、novel_37、novel_39、novel_101、novel_4、novel_40上调表达，与MITF、SOX10、ATF2等存在潜在结合位点。
(4)虾青素对白条双锯鱼体表Lab值具有显著影响，可使红度(a*)值显著升高，亮度值显著减弱(P＜0.05)。随饲料虾青素添加量的升高，体表黑色素细胞密度显著升高(P＜0.05)、体积增大、树突状分支增多。鳍条虾青素含量与饲料虾青素添加量呈正相关。添加量150mg/kg之前，皮肤虾青素含量随饲料虾青素添加量的升高而显著升高(P＜0.05)。各组肌肉组织中的虾青素含量无显著性差异(P＞0.05)。添加量150、200mg/kg两组的皮肤红度值(a*)和虾青素含量无显著性差异(P＞0.05)，投喂150mg/kg饲料即可达到最佳红度(a*)值和皮肤最高虾青素蓄积量。添加量50mg/kg组，鳍条叶黄素含量显著高于其他组(P＜0.05)，其余组织各组叶黄素含量均无显著性差异(P＞0.05)。MITF基因在皮肤中下调表达(P＜0.05)，脑和肌肉中的表达量均呈先升高后降低趋势，3组和2组分别为该两种组织的表达量最高点，极显著高于对照组(P＜0.01)。TYR基因在肌肉组织中极显著上调表达(P＜0.01)，在除第4组外的皮肤和脑组织中显著上调表达(P＜0.05)。SOX10基因在皮肤中下调表达，肌肉中除第4组外均上调表达，脑组织中2、3组上调表达，4、5组下调表达(P＜0.01)。