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研究背景和目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是临床常见的条件致病菌,广泛分布于自然界及健康人的皮肤、肠道和呼吸道,常感染免疫力低下患者,由它引起的院内感染高达30%以上。由于该菌耐药性强,耐药谱广,对多种抗菌药物表现出天然或获得性耐药性,故其所致感染可供选择的有效抗菌药物较少。碳青霉烯类抗生素由于其抗菌活性强,抗菌谱广,并且对大多数β-内酰胺酶稳定,被认为是治疗PA感染最有效的药物之一,其中亚胺培南(泰能)、美罗培南在临床上被广泛使用。然而由于广谱抗菌药物的广泛应用和不合理使用,使得PA的耐药性愈来愈强,出现了大量对亚胺培南和常用抗假单胞菌药物都耐药的多重耐药菌株,给临床治疗带来极大的困难。鉴于PA感染,尤其是耐亚胺培南PA感染治疗困难的主要原因是其具有多重耐药性,耐药机制较为复杂,且随地域和感染时期的不同而有差异；同时,医院感染日益增多,由多重耐药菌株引起的医院感染暴发流行时有发生,给病人、医院和社会都带来严重的损失。因此本实验对临床分离的耐亚胺培南PA进行耐药表型、基因型和分子流行病学的研究,(1)采用微量肉汤稀释法及聚合酶链反应检测耐亚胺培南PA的耐药表型和常见耐药基因型,从不同层面上发现广州地区耐亚胺培南PA的多重耐药情况和耐药机制；(2)采用脉冲场凝胶电泳及多基因聚类分析对本地区耐亚胺培南PA进行同源性分析,明确所感染的菌株是否同源,判断是散在性感染还是暴发流行性感染,为预防和控制本地区医院感染提供理论依据。方法收集2008年1月至2009年1月从广东省中医院四家分院住院患者临床标本中分离到的384株非重复PA,其中72株为耐亚胺培南PA,所有菌株经法国梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定仪鉴定。(1)采用纸片扩散法检测384株PA对12种临床常用抗菌药物的药敏情况；(2)采用微量肉汤稀释法检测72株耐亚胺培南PA对12种抗菌药物的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);(3)采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测Ⅰ类整合子遗传标记intI1,外膜通道蛋白基因OprD2,A类p-内酰胺酶基因GES、KPC,B类β-内酰胺酶(即金属β-内酰胺酶)基因IMP-1、IMP-9、VIM-1、VIM-2、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM、KHM,C类β-内酰胺酶基因DHA、PDC,D类β-内酰胺酶基因OXA-40、OXA-23；(4)对PCR检测所获得的耐药基因结果进行多基因聚类分析,并采用脉冲场凝胶电泳对72株耐亚胺培南PA进行分子分型和菌株的同源性分析。结果(1)384株PA对环丙沙星和替卡西林的耐药率最高,均为39.9%；亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为18.8%和18.5%。(2)药敏检测结果发现有72株PA对亚胺培南耐药,且均为多重耐药菌株,对12种抗菌药物的耐药率均大于50%,明显高于所有PA对相应抗菌药物的耐药率。72株耐亚胺培南PA不仅对抗菌药物耐药种类广泛,而且耐药水平高。除了美罗培南、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦外,其余抗生素MIC值为耐药折点四倍或四倍以上的菌株株数都超过50%。(3)采用PCR在72株耐亚胺培南PA中成功检测出Ⅰ类整合子遗传标记intI1;外膜通道蛋白基因OprD2;A类β-内酰胺酶基因KPC；B类β-内酰胺酶IMP-1、IMP-9、VIM-2、SIM、AIM、NDM;C类p-内酰胺酶基因DHA、PDC。其检出率分别为100.0%(72株)、86.1%(62株)、2.8%(2株)、9.7%(7株)、70.8%(51株)、13.9%(10株)、1.4%(1株)、2.8%(2株)、1.4%(1株)、18.1%(13株)、98.6%(71株)；GES、VIM-1、SPM、GIM、KHM、OXA-40、OXA-23等基因无阳性检出。本实验耐亚胺培南PA所携带耐药基因的种类和数量有差异,但对抗生素的耐药水平较一致。(4)72株耐亚胺培南PA的脉冲场凝胶电泳图谱可分成17基因型(A-Q),其中A型40株、B型6株、C型6株、D型5株、E型2株、F型2株,G型至Q型分别各有1株；经过对A型至F型各型中的菌株来源进行查证,发现各型中的菌株来源于不同医院的不同时期,并未构成暴发流行。18种基因为分子标记的聚类分析结果显示72株耐亚胺培南PA可分三群,每群均存在克隆传播,A群3-5-11-13-16-17-18-19-22-23-24-25-31-36-40-41-46-47-50-59-60-65-69-70-71-85号菌株为克隆传播,2-6-7-8-9-10-12-14号菌株,1-15-33-37-38-43-45-53-55-57-62-64-78-81-83号菌株,42-44-51-58-61号菌株,29-30号菌株,28-32-34号菌株也都分别为克隆传播；B群中48-54-66-82号菌株为克隆传播；C群中27-V2号菌株为克隆传播。多基因聚类分析法中同一群的菌株在脉冲场凝胶电泳被归到不同的基因型。结论本地区72株耐亚胺培南PA均具有多重耐药性,且耐药水平高,耐药水平的高低不仅与耐药基因的种类和数量有关,而且与耐药基因的表达情况有关。新型金属β-内酰胺酶SIM、AIM和NDM的出现说明介导细菌耐药的机制日趋复杂。脉冲场凝胶电泳结果提示本地区虽未发生暴发流行,但仍存在流行优势克隆株。因此需积极配合医院感染管理部门进行耐药性监测,防止医院感染和暴发流行。脉冲场凝胶电泳和多基因聚类分析两种分子分型方法各有特点,应根据临床需要选择合适的方法。