各种原因所致耳蜗毛细胞不可逆性的缺失,引起随之发生的螺旋神经节和听神经的凋亡和变性,从而导致感音神经性耳聋的发生。随着人工耳蜗植入术(CI)的发展,多数保留有足够数量螺旋神经节细胞(SGNs)的耳聋患者在这项技术中受益,听力得到提高。具有一定正常形态和功能SGNs的数量对于CI技术的发展是一个限制性的因素,通常认为残存的SGNs的数量应占总量的10%以上。SGNs的存活依赖于听觉感受器、蜗核、髓鞘等分泌的神经营养因子;除此之外,还依赖于毛细胞释放的神经递质如谷氨酸、P物质和乙酰胆碱等诱发的SGNs细胞膜的生物电活动。在螺旋神经节细胞的存活、再生、轴突的塑型和神经网络的建立中,神经生长因子NGF起着不可忽视的作用。NGF是一种高效多能的神经营养因子,由三种亚基α、β、γ,按α2βγ2的排列组成,分子量为1300000D,其中只有β亚基具有生物学作用。神经生长因子在神经系统发育期,具有促进神经元的分化,控制神经元存活数量等作用;在神经元发育成熟期,具有维持感觉神经元和中枢神经元群的功能,促进成熟神经元轴索分支等作用;神经损伤修复期,NGF具有类似发育期的作用,支持神经元的存活并促进神经纤维的生长。Lefebvre等在培养的大鼠耳蜗前庭神经节中加入胚胎12天的听泡,发现听泡能释放出一种因子促进培养神经细胞的存活和轴突的发生,这种因子的作用类似NGF,其作用能被抗MGF抗体阻断。NGF是与其受体相结合后发挥其生物学效应,高亲和力TrkA受体被公认为NGF功能性受体,与NGF结合能使细胞内络氨酸蛋白激酶活性增高,继而发生一系列级联反应,最终达到维持细胞存活、促进细胞成熟的效应。Dai在用兔的抗TrkA的多克隆抗体对啮齿类动物(大鼠、小鼠)进行NGF受体TrkA分布的研究,发现在大鼠和小鼠中的螺旋神经节细胞均有TrkA的表达。通过与受体的结合,NGF发挥对SGNs的保护作用。目前外源性NGF直接提纯较为困难,来源受限;并且因其属于大分子物质,不易通过血-迷路屏障,临床应用存在着很大的难度。内耳包被于骨性结构内,并因血-迷路屏障的存在而与周围组织形成相对独立的微环境,由于膜性迷路悬浮于内、外淋巴的液态环境之中,淋巴液的不断循环流动,有利于转移载体在膜迷路系统的扩散,赋予内耳基因转移自身的特点。腺病毒是一种线性双链DNA病毒,能感染所有类型的细胞,对纠正神经细胞的基因缺陷有特殊意义,表达效率高,具有较高的安全性,是一类适合内耳基因治疗的载体。为了研究外源性βNGF能否经病毒介导感染螺旋神经节细胞,发挥对SGNs的存活作用,我们首先研究了βNGF在不同发育阶段豚鼠耳蜗中的分布规律,间接了解βNGF在不同阶段对耳蜗各部分的作用;然后构建了携带绿色荧光蛋白报告基因和βNGF目的片断的重组腺病毒表达载体AD-βNGF,将AD-βNGF感染离体培养的螺旋神经节细胞和基底膜后并在细胞和组织中获得了表达;通过圆窗膜注射将AD-βNGF导入豚鼠膜迷路内,病毒成功感染柯替器及SGNs;在药物性耳聋动物模型中,导入βNGF的SGNs存活情况较好,但在脑干诱发电位测试中Ⅲ波的听阈值较正常值增高。主要实验结果如下:1、选取胚胎20天、出生后7天和成年的豚鼠,常规制备耳蜗石蜡切片,兔抗小鼠βNGF多克隆抗体(1:200)行免疫组织化学染色。结果显示胚胎20天的豚鼠耳蜗外嵴部(分化形成柯替器)的细胞胞浆染色阳性,蜗轴中与外嵴部延续的细胞(幼稚螺旋神经节)胞浆染色阳性。出生7天和成年的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞βNGF染色为阳性,发自神经节细胞的染色阳性的神经纤维支配内外毛细胞;基底膜上内、外毛细胞染色强阳性(深棕黄色),蜗轴中排列成束的神经纤维染色也为阳性。经蛋白质免疫印迹行定量检测提示在这三个发育阶段出生后7dNGF含量最多,成年后含量最少。2、从小鼠颌下腺组织提取总RNA后,用RT-PCR法扩增了924bp长度的小鼠βNGF基因cDNA,经过电泳、回收、纯化后与携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-cmv-eGFP重组成pAdtrack-cmv-eGFP-βNGF,转化大肠杆菌DH5α后在细菌中扩增质粒,经过质粒抽提、酶切、电泳、回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1同源重组,经酶切鉴定、电泳分析和DNA测序鉴定,924bp的βNGF基因片断成功插入到腺病毒载体中,插入方向正确。和GenBank数据库中的序列比对后确认无误,说明载体构建成功。转化菌扩增后抽提质粒,经脂质体转染293细胞,在293细胞中包装成具有感染能力的完整的腺病毒颗粒。荧光显微镜下观察转染的第二天即有部分293细胞发出绿色荧光,随着培养天数的增加,发出GFP的293细胞数目增多,在转染第7～10天时最多,荧光最强,细胞的形态较正常有变化,形成串珠状,以后逐渐减弱,发出荧光的细胞数减少。在转染的第7～10天是采集病毒液的最佳时期。将细胞破碎离心后,取上清,重复感染293细胞,3天左右即可再次收集病毒液,达到快速扩增病毒液的目的。经TCID50法测定,收集的病毒液滴度达1×107.4PFU/mL。以病毒液为模板,通过βNGF目的基因引物PCR扩增出924bp的目的基因片段,说明腺病毒是重组的,排除了在包装病毒液的过程中野生型腺病毒的产生。3、在解剖显微镜下分离出生3～5d的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞,经消化后移入涂有0.1%多聚赖氨酸的平皿中培养,培养中,SGNs一般在12h左右贴壁,24h后呈良好长势,连续培养7d细胞体形态良好,轴突长度无明显改变,培养到第14d左右,细胞数目明显减少,胞体中可见空泡,轴突变小变细,多数细胞崩解。将病毒液在培养后第2d加入培养液中,显微镜下观察绿色荧光,在转染后第2d可见部分细胞发出荧光,荧光很弱,细胞形态无明显改变,随着培养天数的增加,发出荧光的细胞数增多,荧光也随之增强,处于细胞体的荧光较轴突强,有些细胞的荧光主要集中在细胞核周围,转染第5d,荧光数最多最强,连续培养14天,多数细胞胞体和突起的形态较正常无明显改变。经SGNs计数,非转染组细胞减少明显较转染组显著(P<0.05)。4、重组腺病毒转染三维离体培养的基底膜,第7天,基底膜上发出荧光的细胞数最多,荧光强度最强,绿色荧光蛋白的表达在螺旋神经节细胞、神经纤维、毛细胞中最强;连续培养14天,基底膜上细胞的层次分明,组织结构没有明显改变,组织的有序性明显高于非转染组。5、为了检测βNGF对活体耳蜗和SGNs的保护作用,豚鼠随机分成四组:病毒组A,庆大霉素组B,病毒组+庆大霉素组C,正常组D。通过圆窗膜将病毒液注入豚鼠耳蜗鼓阶中,注射后以颞肌筋膜贴附在圆窗上,窗缘周围用软组织填塞以防病毒液渗漏。B组耳蜗内不注射病毒液,每日肌注庆大霉素80mg/kg,连续10天。C组在耳蜗注入病毒液后第三天每日肌注庆大霉素80mg/kg,连续10天。于感染后第10～12d处死动物,检测各组豚鼠ABR听阈值,处死后制备石蜡切片,甲苯胺蓝染色观察螺旋神经节细胞尼氏小体形态和数目。在病毒组A中,ABR引出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ波,Ⅲ波听阈与正常无显著性差异(p>0.05)。在庆大霉素的干预下,庆大霉素组脑干诱发电位无明显波形引出;病毒组+庆大霉素组C有波形引出,但是听阈值高于正常(p<0.05)。庆大霉素B组螺旋神经节细胞尼氏小体多数分解,病毒组+庆大霉素C组尼氏小体少数分解,大部分仍保持正常形态。我们通过观察βNGF在耳蜗不同发育阶段的分布和量的变化,了解了βNGF在耳蜗不同发育阶段中的地位和作用;成功构建了携带βNGF基因片段的腺病毒表达载体AD-βNGF;将病毒液转染离体培养的SGNs和耳蜗基底膜,观察βNGF对SGNs直接和间接的保护作用,为后续的研究打下了基础;AD-βNGF成功感染了活体的耳蜗,感染范围广,未发现明显的细胞毒性和炎性反应,提示腺病毒用于耳蜗的基因干预具有一定的安全性,同时βNGF的表达对给予了庆大霉素的SGNs有一定的保护作用,为外源性βNGF保护SGNs变性提供了一条可供参考的防治途径。