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恶性肿瘤是常见病和多发病,根据2016年世界癌症报告显示,现在全世界每年癌症病例大约有2200万,其中我国每年新发癌症病例约310万,死亡约200万,癌症已成为我国死亡的第一大原因,加上当今食品安全、环境恶化等的问题越来越严峻,使越来越多的人患上恶性肿瘤,可以说恶性肿瘤是人类健康的重要杀手,寻找优质的抗癌疗法成为目前的当务之急。免疫治疗作为一种新兴治疗措施[1],特别是其中针对PD-1/PD-L1免疫抑制通路的肿瘤免疫治疗是当前全世界备受瞩目、广为研究的新一类抗癌疗法[2]。抗PD-1/PD-L1抗体通过阻断肿瘤免疫抑制激活人体的自身免疫反应而特异、持续的识别肿瘤细胞[1],对于存在免疫逃逸且逃逸机制明确的恶性肿瘤患者,免疫治疗阻断免疫逃逸或激活肿瘤免疫反应,理论上即可做到全面、彻底地清除肿瘤细胞,治愈恶性肿瘤,而且很少出现严重不良反应。但是恶性肿瘤的特征之一是异质性,患同一种肿瘤的不同患者,其肿瘤在组织学、抗原性、免疫性、激素受体表达水平、肿瘤细胞的代谢性、生长速度、对化学药物治疗的敏感性等均存在差异[2],因此,其对免疫治疗的敏感性亦存在差异。备受瞩目的肿瘤免疫疗法--PD-1抗体疗法,针对晚期黑色素瘤的治愈率只有20-30%,较低治愈率主要是因为不同的黑色素瘤患者,肿瘤发生、发展的病理机制不同,有的因PD-1/PD-L1通路激活而逃脱机体免疫监视,有的则通过其它方式逃脱。虽然免疫疗法的疗效好,毒性低,但目前仅部分病人即免疫逃脱机制明确的人受益。放疗和免疫疗法的联用,目的就是为了扩大免疫疗法的适应范围并提高疗效。目的:以小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10细胞制备实验性肿瘤模型,观察放疗联合抗PD-L1抗体治疗对小鼠实验性黑色素瘤的疗效,以及放射治疗对肿瘤微环境的影响,包括对肿瘤组织中PD-L1的表达情况以及对肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的影响,了解放射治疗联合抗PD-L1免疫治疗的疗效及可能的作用机制。方法:1.放射联合抗PD-L1抗体治疗对小鼠黑色素瘤的治疗作用(1)建模和治疗:选用雄性小鼠,以B16-F10黑色素瘤块接种的方法建立实验性小鼠黑色素瘤模型。选建模成功的小鼠,随机分为5组,即放射治疗组、抗PD-L1治疗组、先放射后抗PD-L1治疗组、先抗PD-L1后放射治疗组和对照组。放射治疗组小鼠腹腔注射200mg/kg(5%水合氯醛,0.4ml/100g)麻醉,然后进行局部放疗,治疗强度为57s/Gy即单局部放25Gy;抗PD-L1抗体治疗组小鼠尾静脉注射抗PD-L11mg/kg;先局部放射25Gy+抗PD-L1抗体组则小鼠放疗25Gy一周后尾静脉注射抗PD-L1抗体1mg/kg;先抗PD-L1抗体+放射25Gy治疗组小鼠尾静脉注射抗PD-L1抗体1mg/kg,连续观察一周后,然后局部放疗25Gy;对照组尾静脉注射等体积生理盐水,麻醉但不照射。共治疗两周,每天测量体重、肿瘤的长径跟短径,计算肿瘤体积。(2)疗效及机制观察:两周后取瘤块,称瘤重,计算抑瘤率[3]。取肿瘤组织进行HE染色,观察联合治疗对肿瘤生长情况[4]的影响,观察肿瘤组织病理变化及淋巴细胞浸润情况。2.B16-F10黑色素瘤细胞PD-L1的基础表达水平B16-F10黑色素瘤细胞的培养;流式细胞术和Western-blotting检测B16-F10细胞PD-L1的体外表达水平。3.放射治疗对小鼠实验性B16-F10黑色素瘤肿瘤微环境的影响:(1)建模:建立小鼠黑色瘤模型,建模成功后,小鼠随机分2组,放射治疗组小鼠肿瘤局部25Gy放射治疗一次,对照组小鼠麻醉但不照射,一周后取瘤块分别制备病理切片、分离肿瘤组织细胞以及提取肿瘤组织蛋白,用于下列实验。(2)对肿瘤微环境的观察:(1)对PD-L1的影响:用流式细胞术和Western-blotting检测两组肿瘤组织PD-L1的表达情况;(2)对肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)的影响:取肿瘤组织进行免疫组化染色(CD8)[5],观察局部放疗后肿瘤组织TILs的变化。(3)对血管生成因子(VEGF)的影响:取肿瘤组织进行免疫组化染色,观察局部放疗对肿瘤组织VEGF的变化。结果:1.肿瘤局部放疗联合抗PD-L1抗体对小鼠B16-F10黑色素瘤实验性肿瘤的治疗作用(1)肿瘤局部放疗联合抗PD-L1抗体对小鼠实验性肿瘤体积和瘤重的影响:对肿瘤体积的影响:荷瘤小鼠采用不同方式治疗14d后,在位测定肿瘤体积结果:(1)放疗组:2653±699mm3;(2)抗PD-L1抗体组:829±291mm3;(3)先放疗+后抗PD-L1抗体组:432±156mm3;(4)先抗PD-L1抗体+后放疗组:118±65mm3;(5)对照组:4180±1257mm3,说明局部放射治疗联合抗体治疗对抗肿瘤效果最好。对肿瘤重量的影响:小鼠实验性黑色素瘤经过局部放疗联合抗PD-L1治疗14d后,取瘤块,称瘤重,结果如下:(1)放疗组:瘤重为2.40±1.09g;(2)抗PD-L1抗体组:0.49±0.36g;(3)先放疗+后抗PD-L1抗体组:0.12±0.09g;(4)先抗PD-L1抗体+后放疗组:0.03±0.02g;(5)对照组:4.71±2.02g各治疗组肿瘤重量明显小于对照组,均有极显著性差异(P<0.01),说明放疗、抗PD-L1以及两者联合治疗是治疗黑色素瘤的有效方法。联合治疗组瘤重明显小于放疗组或单抗体组,差别具有显著性(P<0.01),说明抗PD-L1联合放疗对小鼠黑色素瘤的治疗效果优于放疗或仅单抗治疗;先放疗后抗体治疗组与先抗体治疗后放疗组比较,两者瘤重则没有显著性差异(P>0.05),说明在联合放疗和抗PD-L1抗体免疫治疗中,两种治疗的先后顺序对疗效没有明显影响。(2)肿瘤局部放疗联合抗PD-L1抗体对小鼠实验性肿瘤组织形态学的影响:从中可知,(1)对照组肿瘤细胞生长旺盛,细胞排列紧密形成致密癌巢,瘤组织周边有可见的淋巴细胞浸润(+),且存在最多的核分裂相平均值为16个/高倍视野;(2)放疗组肿瘤细胞同样生长比较旺盛,细胞排列紧密,有可见性坏死灶,但坏死轻微(+),瘤体积有所缩小,瘤组织中可见较多淋巴细胞浸润(++),且存在较多的核分裂相平均值为8个/高倍视野;(3)抗PD-L1抗体组肿瘤的坏死灶明显(++),有大量坏死的区域,瘤体积大大缩小,且肿瘤中有大量的淋巴细胞浸润(+++),存在较多的核分裂相平均值为6个/高倍视野;(4)放疗+抗PD-L1抗体组,肿瘤的坏死灶更多(+++),有大量坏死的区域,瘤体积大大缩小,且肿瘤中有大量的淋巴细胞浸润(+++),存在较少的核分裂相平均值为3个/高倍视野;(5)抗PD-L1抗体+放疗组,肿瘤的坏死灶更多(+++),有大量坏死的区域,瘤体积大大缩小,且肿瘤中有大量的淋巴细胞浸润(+++),存在较少的核分裂相平均值为2个/高倍视野。由此结果说明,与对照组相比,各治疗组的坏死面积变大,淋巴细胞浸润增多,病理性核分裂相减少,尤以联合治疗组为明显。2.B16-F10黑色素瘤细胞PD-L1的基础表达水平流式细胞术和Western-blotting结果显示,B16-F10黑色素瘤细胞株PD-L1蛋白表达量较多。说明B16-F10黑色素瘤细胞株上PD-L1的体外表达水平较高。3.放射治疗对小鼠B16-F10黑色素瘤实验性肿瘤模型的肿瘤微环境的影响(1)对PD-L1的影响:采用流式细胞术观察肿瘤细胞PD-L1表达的情况,发现放疗组PD-L1阳性率为71.13%±4.179%,与对照组PD-L1阳性率20.07%±3.900%比较,明显升高(P<0.01),说明放疗可使肿瘤组织高表达PD-L1;Western-blotting结果为,放疗组PD-L1的表达率为81.21%±4.31%,对照组PD-L1表达率为59.07%±5.070%(P<0.05)。由流式细胞术和Western-blotting结果,说明放疗25Gy具有提高肿瘤组织上PD-L1的体内表达水平。(2)对TILs的影响:免疫组化结果为,放疗25Gy组肿瘤组织上CD8的表达水平呈强阳性(+++),对照组CD8的表达水平呈弱阳性(+),由此说明放疗25Gy具有使肿瘤组织中TILs的水平显著提高的作用。(3)对VEGF的影响:免疫组化结果,对照组肿瘤组织上VEGF的表达水平呈强阳性(+++),放疗25Gy组VEGF的表达水平呈弱阳性(+),说明放疗25Gy具有使肿瘤组织VEGF的水平降低的作用。结论:1.放疗联合抗PD-L1抗体治疗对小鼠黑色素瘤具有良好的治疗作用,可促进肿瘤组织的坏死,增加淋巴细胞的浸润。2.放射治疗具有诱导小鼠实验性黑色素瘤组织PD-L1表达,增加TILs数量,抑制VEGF表达的作用。