论文部分内容阅读
近年研究表明,LncRNA作为亚细胞结构的组织框架,通过RNA的形式来调控蛋白质的活性,并且成为细胞中的关键调控分子。LncRNA也可能参与靶基因的表观遗传调控,从而导致靶基因的转录受到抑制。LncRNA与肿瘤发生发展有着关系密切,LncRNA可能发展为肿瘤诊断、治疗和预后判断的重要生物标志物和靶点。目前,课题组前期发现Lnc00665是一个原癌基因,能够促进脑胶质瘤细胞的增殖,但是miRNA对Lnc00665的调控作用研究还不是很清晰,所以本论文将从miR-1224-5p inhibitor的角度来研究miRNA对Lnc00665的调控作用。课题组前期利用生物信息学的分析,通过qRT-PCR、双荧光素酶报告系统检测和突变实验确认Lnc00665受到了miRNA-1224-5p的直接调控作用;前期工作对胶质瘤细胞进行miRNA-1224-5p瞬时转染,过表达后抑制脑胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。因此,为了进一步的研究,我们将通过对miRNA-1224-5p inhibitor转染后对胶质瘤细胞增殖与迁移的机制进行研究。为了更深层次的研究miRNA-1224-5 p inhibitor对U251细胞、U87细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,我们将miRNA-1224-5p inhibitor转染到胶质瘤U251、U87细胞中,通过MTT增殖曲线和克隆形成分析发现,当miRNA-1224-5p inhibitor转染到脑胶质瘤细胞中,U251、U87细胞增殖能力明显升高;通过细胞周期实验发现,当转染miRNA-1224-5p inhibitor后发现G0/G1期的细胞数量显著减少,S期无明显变化,G2/M期的细胞数量明显增加;通过免疫印迹实验发现,miRNA-1224-5p inhibitor转染后,cyclinD1表达水平明显升高。而后我们通过Transwell小室实验发现,当miRNA-1224-5p inhibitor转染后,U251细胞、U87细胞的迁移以及侵袭能力明显升高。从而证实miRNA-1224-5p inhibitor转染后促进U251细胞、U87细胞的增殖、迁移与侵袭能力。同时对过表达Lnc00665的细胞系进行裸鼠体内成瘤实验,选取4周龄雌性BALB/C-nu裸鼠,右侧背部皮下注射Lnc00665过表达的U251细胞悬液,饲养35天处死裸鼠后,我们发现Lnc00665过表达后肿瘤的大小明显增大;并称量解剖瘤体的重量。利用实时定量PCR检测裸鼠成瘤组织Lnc00665的表达水平,发现Lnc00665表达水平明显升高。并通过免疫组化来检测增殖标志物PCNA的表达,Lnc00665过表达的脑胶质瘤组织中PCNA细胞阳性数量明显增多,进一步验证Lnc00665过表达后在体内促进脑胶质瘤细胞增殖。上述实验结果证明Lnc00665受到miRNA-1224-5p的调控从而影响脑胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭能力。本论文将为脑胶质瘤癌症的确诊和诊疗提供一定的帮助。