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细胞核移植技术不仅是研究细胞核与细胞质相互作用的重要手段,而且是在医学和农业等领域都将有着广泛的应用前景的一项重要胚胎工程技术。尽管近来哺乳动物体细胞核移植克隆已经取得了很大进展,但实践证明猪的克隆难度最大,有许多问题亟待解决。本实验对猪体细胞核移植及其相关问题如细胞融合、卵母细胞激活和卵母细胞体外成熟进行了研究。结果如下: 1.将卵丘细胞直接注入卵母细胞或将培养的颗粒细胞与卵母细胞融合,供核细胞都能发生染色质提前凝集(PCC);将培养的颗粒细胞与去核的卵母细胞融合后,核重组变化方式与直接注射法的结果相似,但是融合培养的颗粒细胞要比直接注射卵丘细胞的发育速度快。 2.将卵丘细胞直接注入卵母细胞构建核移植胚胎,在中间受体内发育到囊胚。 3.猪-猪同种核移植胚胎和猪-小鼠异种移核胚胎激活后,异种重组胚多形成二原核(2PN),而同种重组胚则主要形成一原核(IPN)。 4.Ionomycin/6-DMAP或只用Ionomycin能够有效地激活猪卵母细胞,激活率可达84.3%和88.9%;电刺激/6-DMAP与化学刺激/6-DMAP激活方法在激活率上虽然没有明显差异,但电激活的卵裂率明显高于化学激活。 5.采用相对较低场强(0.8V/cm左右)和长脉冲(60μs)组合的重组胚胎的融合率高于高场强(2.1kv/cm左右)和短脉冲(20μs)的组合。 6.采用活体荧光染料Hocest33342对猪的生发泡进行了观察,发现猪GV染色质构型有五种类型;腔前卵泡卵母细胞都为GV-0染色质构型;随着卵泡的发育,GV-1卵母细胞比例增高;体外成熟过程中,随着培养时间的延长,GV-3的比率增加,但在体内,注射PMSG和hCG后没有观察到GV-3期,只是在注射hCG后18-24小时GV-2的比率增加。 7.无论是A类卵还是B类卵,在不含激素培养液中前培养12小时,并没有使卵母细胞GV染色质同步化,但就A类卵而言,成熟卵中极体完整的比率显著提高。 8.激素水平对卵丘扩展有影响,但随培养时间的延长,对激素的要求有逐步减少的趋势;猪卵丘扩展不依赖于卵母细胞,卵母细胞核成熟也与卵丘扩展无关;GV期卵母细胞、小腔卵泡内颗粒细胞和成熟卵的卵丘细胞都有较高的分泌CEEF能力;3-6mm卵泡的壁颗粒细胞不能分泌CEEF,但3—6mm卵泡的卵泡液中有CEEF。