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研究目的: 本研究通过构建人Hedgehog通路关键分子SMO/GLI1过表达/低表达的非小细胞肺癌细胞株，验证SMO和GLI1对非小细胞肺癌细胞侵袭的调控作用,并通过分析SMO/GLI1对肺癌细胞上皮间质转化(Epithylial-Mesenchymal Transition,EMT)的调节作用，初步探讨其调控非小细胞肺癌细胞侵袭的分子机制。 研究方法: (1)基于带有HA或Flag标签的质粒pcDNA3.1构建人SMO和GLI1过表达载体，通过脂质体转染H1299和A549细胞，构建SMO/GLI1过表达非小细胞肺癌细胞株；设计并合成靶向人SMO/GLI1的小干扰RNA(siRNA)，通过脂质体转染上述两种肺癌细胞，构建基因敲低细胞株。通过荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹方法，检测基因及蛋白水平过表达或敲低效果。 (2)应用Transwell小室实验，检测SMO和GLI1过表达/敲低对非小细胞肺癌细胞侵袭的影响。将浓度为1mg/ml的基质胶(Matrigel) 铺于上室聚碳酸酯膜上，每孔50ul，待胶凝固后接种培养细胞16h后进行固定及DAPI染色，荧光显微镜下每组随机选择5个视野进行拍照，使用ImageJ软件分析穿膜细胞数，以上室细胞穿过基质胶和聚碳酸酯膜的百分数反映细胞的侵袭力。 (3)应用Westernblot方法，检测SMO和GLI1过表达的H1299细胞中，EMT标志物E-cadherin、N-cadhenrin和Vimentin的表达情况,分析SMO、GLI1对EMT的调节作用。 (4)应用SPSS16.0统计学软件进行数据分析。数据采用独立样本t 检验分析。P值≤0.05 为显著性差异标准，P 值≤0.01 为极为显著性差异标准。所有实验均为独立重复三次。 研究结果: (1)酶切鉴定及测序结果表明，成功构建SMO、GLI1过表达载体p3xHA-SMO和p3xFlag-GLI1。荧光定量PCR和Westernblot结果显示，转染过表达载体或siRNA显著提高/降低了SMO/GLI1在非小细胞肺癌细胞H1299和A549中的表达，其中在mRNA水平，与对照组相比，转染过表达载体的H1299/A549细胞， SMO表达分别为对照组的2.927倍(P=0.00041)和2.790倍(P=0.0045)， GLI1表达分别为对照组的3.446倍(P=0.00049)和2.660倍(P=0.0036)；转染siRNA的H1299/A549细胞，SMO表达分别降低98%(P=0.0211)和53.3%(P=0.0098)， GLI1表达分别降低67.9%(P=0.0017)和74.4%(P=0.0018)。 (2)Transwell实验结果显示，在H1299/A549细胞中，与对照组相比，SMO敲低组细胞侵袭力分别降低66.5%(P＜0.05)和74.2%(P＜0.05)；GLI1敲低组细胞侵袭力分别降低55.2%(P＜0.05)和80.1%(P＜0.05)。 (3)Transwell实验结果显示，在H1299/A549细胞中，与对照组相比，SMO过表达组穿膜细胞数分别为对照组的1.623倍(P＜0.05)和1.664倍(P＜0.05)；GLI1过表达组穿膜细胞数增强分别为对照组的1.680倍(P＜0.05)和1.588倍(P＜0.05＝，表明SMO或GLI1过表达促进了非小细胞肺癌细胞的侵袭。 (4)WesternBlot结果显示，在H1299细胞中，与对照组相比， SMO/GLI1过表达组上皮标志基因E-cadherin表达明显下调，间质标志基因N-cadherin/Vimentin表达明显上调，表明SMO/GLI1过表达促进了EMT。 研究结论: Hedgehog信号通路关键分子SMO和GLI1可促进非小细胞肺癌细胞的侵袭，进而可能促进临床肺癌的转移。该作用可能是通过促进EMT而实现的；SMO和GLI1基因干扰可显著抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭，因而可作为临床非小细胞肺癌治疗的潜在靶标。