桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属于双翅目(Diptera),实蝇科(Tetrphitidae),果实蝇属(Bactrocera macpuart),寄主范围广,是为害多种水果和蔬菜的世界性害虫。自传入我国以来,迅速扩散至广东、广西、台湾等沿海地区,近年来自南向北继续扩散至江苏、浙江、湖北等省市。桔小实蝇主要通过幼虫在果实内部危害,导致瓜果腐烂、脱落,而造成巨大的经济损失。这种特殊的危害方式导致幼虫的危害在早期难以被发现,而传统的化学防治也难以达到防控的目的。昆虫生长调节剂以其环保且对人畜无害等优点成为研究的热点,它的作用靶标较多,几丁质就是其中之一。几丁质广泛存在于节肢动物、线虫、酵母等非哺乳动物体内,由于其存在的特殊性而引起研究者们的广泛兴趣——作为害虫防治的靶标研发新型环保农药等生物制剂,从而达到田间防控害虫的目的。几丁质的合成是一个复杂的过程,至少需要8种酶的共同参与,其中某一个过程受阻就会导致几丁质的合成受阻,导致昆虫因缺少几丁质而不能存活。本学位论文针对参与几丁质合成通路上的3个重要的酶(几丁质合成酶2,Chitin synthase2;葡萄糖-6-磷酸异构酶,Glucose-6-phosphate isomerase; UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶,UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase),通过分子克隆,定量表达,饥饿饲喂,几丁质含量测定,抑制剂生物测定等方法,对桔小实蝇这3个基因的分子生物学特性进行了初步的研究,主要结果如下：1.桔小实蝇几丁质合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的cDNA全长克隆及序列分析从本实验室测序获得的桔小实蝇转录组中获取相应的Unigene片段,通过Overlapping技术获得cDNA大片段,然后结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术,成功地从桔小实蝇体内分离克隆获得3个几丁质合成通路上的基因BdCHS2、BdG6PI和BdUAP的cDNA全长序列,GenBank登录号分别为KC354694、JQ925874及JX434756。通过序列分析,明确了这3个通路基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用相应的软件预测蛋白质的理化性质、保守基序、跨膜结构等生理功能。另外,从NCBI上下载其他物种相应基因的cDNA序列,借助Mega5.04软件并应用Neighbor Joining方法构建相对应的系统发育树,进一步明确与其他物种之间的遗传距离。该研究结果丰富和发展了桔小实蝇几丁质合成通路基因的遗传信息,为深入探讨几丁质合成机制提供了基础数据。2.桔小实蝇几丁质合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的时空表达分析分别解剖桔小实蝇7日龄幼虫5种组织器官(表皮、气管、中肠、脂肪体和马氏管),然后提取总RNA及合成第一条cDNA链,借助qPCR (Real-time Quantitative PCR)仪,检测桔小实蝇BdCHS2、BdG6PI和BdUAP这3个基因在不同组织部位的表达模式。结果发现BdCHS2基因在中肠的表达显著高于其他4个组织；BdG6PI基因主要分布于脂肪体和马氏管中；BdUAP主要分布在表皮、马氏管和中肠中；BdCHS2、BdG6PI和BdUAP在气管中表达量均低。不同组织器官的定量表达,丰富了对这3个基因的认识。分别收集获得卵、幼虫、蛹和成虫(卵、1-8日龄幼虫、1-10日龄蛹以及新羽化的成虫)等4个虫态的桔小实蝇,然后提取总RNA及合成第一链cDNA,通过qPCR检测几丁质合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在不同发育阶段的表达模式。结果显示桔小实蝇BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在整个发育阶段均有所表达,尤其在幼虫和成虫期的表达量高于卵期和蛹期,且不同基因在不同发育阶段的表达量存在差异。研究结果明确了这3个基因在各个时期的表达情况,为后续基因功能的验证实验提供了前提条件。3.桔小实蝇饥饿及饲喂后几丁质合成通路上BdCHS2、BdG6Pl和BdUAP基因定量表达分析为进一步明确饥饿对桔小实蝇幼虫的影响,实验分别设置饥饿和饲喂处理24h后,饥饿处理的幼虫再饲喂24h,饲喂处理的幼虫再饥饿24h,期间解剖中肠并提取总RNA及合成第一链,通过qPCR技术检测桔小实蝇幼虫经过饥饿-饲喂处理后BdCHS2、BdG6PI和BdUAP这3个基因在中肠的表达模式。结果显示,桔小实蝇经饥饿后再饲喂,BdCHS2基因的表达量比饲喂后再饥饿的高,饥饿-饲喂对该基因影响比较明显；桔小实蝇饥饿后再饲喂,BdG6PI基因的表达量也高于饲喂后再饥饿的处理,而饥饿-饲喂对桔小实蝇幼虫中肠BdUAP基因表达量的影响不显著。该研究结果证实了饥饿能够影响桔小实蝇BdCHS2和BdG6PI基因的表达,而对BdUAP基因的表达影响较低。4.除虫脲对桔小实蝇幼虫的影响挑取桔小实蝇孵化后1日龄幼虫,采用浸渍法进行除虫脲的生物测定。不同浓度除虫脲处理桔小实蝇48h后检测结果,求得除虫脲对桔小实蝇1日龄幼虫的致死中浓度(LCso)为42.05mg/L,且幼虫出现不能蜕皮而死亡的表现型；qPCR检测发现低剂量的除虫脲对BdCHS2基因没有显著性影响。5.几丁质含量测定通过对桔小实蝇幼虫饥饿-饲喂处理,测定单头试虫中肠几丁质含量。结果发现,饥饿及饲喂处理对桔小实蝇几丁质含量影响显著,且与定量表达结果一致,验证了BdCHS2基因在中肠高表达这一结果。通过测定桔小实蝇不同发育阶段的几丁质含量,发现在卵期至幼虫阶段,其几丁质含量呈几何乘幂形式增长,蛹前期几丁质含量较低,后期几丁质含量增高,新羽化成虫的几丁质含量低于最后一天的蛹。上述结果与BdCHS2基因在不同发育阶段的定量表达趋势上存在明显的线性相关性。综上所述,本学位论文克隆获得了3个几丁质合成通路基因(BdCHS2、BdG6PI和BdUAP)cDNA全长序列,丰富了桔小实蝇的遗传信息；在此基础上,借助qPCR技术较为全面地解析这3个基因在不同组织和不同发育阶段的时空表达模式；进一步通过饥饿-饲喂处理探讨了这3个基因的功能；与此同时,通过测定不同发育阶段的几丁质含量,明确了桔小实蝇在整个发育期几丁质的合成情况；最后,初步探究了抑制剂除虫脲对桔小实蝇幼虫及其几丁质合成酶的影响。研究结果为寻找防控害虫的靶标位点提供理论支持,为开发新型农药提供依据,具有较为重要的理论和实践意义。