类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种发病原因不明,以持续性滑膜炎和全身关节性软骨及骨破坏为特点的慢性自身免疫疾病,RA以滑膜炎症和滑膜组织增生为主要病理特征,可引起关节软骨及骨质破坏,最终导致关节畸形及功能障碍,是人类主要的致残原因之一。滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts, FLS)在RA病理过程中起到了关键作用。在临床病理上RA-FLS具有类肿瘤样异常增殖、抗凋亡和释放高水平促炎性细胞因子的特性。FLS参与了RA发病过程中的各个环节,在RA病情进展中扮演着重要角色,RA-FLS通过分泌产生炎性介质、促炎性细胞因子和抗炎症细胞因子调控免疫反应和炎症反应,导致了RA滑膜组织增生：同时,RA-FLS分泌基质金属蛋白酶等参与胞外基质降解及骨关节破坏,促进血管新生。越来越多的证据表明,通过抑制RA-FLS的增殖,能有效防止RA患者的关节损伤,最大限度的改善病情以提高患者生活质量。因此,抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖可能是治疗RA的一种可行有效的临床方案,具有广阔的前景。由热杀死结核分枝杆菌(Heat-killed M.tuberculousis H37Ra, Mtb)诱导的佐剂型关节炎大鼠(Adjuvant Arthritis Rat, AA)临床表现及病理学的改变与临床RA患者相似,是一种复制方法简便、可重复性强,成模率较高的理想RA动物模型。AA大鼠滑膜成纤维细胞(AA-FLS)较RA患者滑膜成纤维细胞(RA-FLS)更容易获取,若可以将AA-FLS用作RA的体外研究,可在短期内培养获得大量细胞模型。因此,我们对AA-FLS的培养方法及细胞特性进行研究,综合评价该细胞模型与RA患者滑膜成纤维细胞的相似性,探讨其作为体外研究RA发病机制及抗RA药物筛选的细胞模型的可行性。过山枫(Celastrus aculeatus Merr.)属于卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属植物,是我国民间风湿骨病的常用药,主要功效为清热解毒、活血止痛,祛风利湿常用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎等症。我们之前的研究发现,过山枫的乙醇提取物可以显著抑制AA大鼠滑膜炎症,同时对大鼠关节滑膜组织及软骨损伤具有保护作用。扁蒴藤素(Pristimerin, Pris)是过山枫有效部位提取物之一,一种天然的木栓烷型五环三萜类化合物,研究报道扁蒴藤素具有抗炎,抗肿瘤等活性,随着对扁蒴藤素的研究发现,扁蒴藤素能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖。本课题组研究证实,扁蒴藤素能够抑制RA滑膜炎症和滑膜血管新生,具有明显的抗RA作用。在前期研究的基础上,我们以在体动物和细胞模型为观察对象,研究了扁蒴藤素对AA大鼠模型和AA-FLS细胞模型的影响,探讨扁蒴藤素对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖的作用,阐明其可能的分子机制。目的：1建立佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维细胞(AA-FLS)的培养方法并分析其生物学特性。2考察扁蒴藤素抑制佐剂型关节炎大鼠(AA大鼠)滑膜组织增生和佐剂型关节炎大鼠滑膜成纤维细胞(AA-FLS)增殖的药效学作用。3阐明扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖作用的分子机制。方法：1 AA-FLS原代培养及特征分析胶原酶法分离获取AA-FLS细胞进行原代培养,观察各代细胞形态特征,免疫细胞化学方法鉴定细胞。CCK-8法检测AA-FLS与正常大鼠FLS的增殖活性差异。ELISA测定细胞TNF-a和IL-1β的分泌水平。Hochest33258法考察细胞凋亡状态,Western Bolt检测AA-FLS细胞线粒体凋亡通路重要调控蛋白Bcl-2和Bax及Pro-Caspase-3和Cleave-Caspase-3的表达水平。2扁蒴藤素对AA大鼠滑膜增生和AA-FLS增殖的抑制作用2.1动物水平佐剂型关节炎(AA)大鼠模型制备：SD大鼠随机分组后,除空白对照组外,其余各组大鼠于根尾部经皮下一次性注射Mtb诱导剂制备AA大鼠模型。观察记录大鼠的一般体征,测定大鼠足体积变化,考察扁蒴藤素对AA大鼠关节肿胀的改善作用。2.2组织水平大鼠膝关节制作病理切片,通过HE染色观察扁蒴藤素对滑膜细胞数量和滑膜组织增生等病理改变的影响作用。2.3细胞水平CCK-8法和台盼蓝拒染实验检测不同浓度扁蒴藤素对AA-FLS增殖抑制的作用。3扁蒴藤素对AA-FLS增殖抑制的作用机制3.1扁蒴藤素对AA-FLS细胞周期的影响用不同浓度的扁蒴藤素处理AA-FLS细胞后,通过流式细胞术对AA-FLS细胞周期进行分析,统计各组细胞周期分布比例的变化与差异,评价扁蒴藤素对AA-FLS细胞周期的作用影响。3.2扁蒴藤素诱导AA-FLS凋亡的作用采用Hoechst 33258染色的方法,对不同浓度扁蒴藤素干预后的AA-FLS进行染色,观察各组荧光染色结果并计算细胞凋亡率,探讨扁蒴藤素诱导AA-FLS凋亡的作用。3.3扁蒴藤素调控AA-FLS中线粒体凋亡通路蛋白水平的表达通过Western Blot的方法,检测不同浓度扁蒴藤素对AA-FLS中Bcl-2、Bax和Pro-Caspase-3 、 Cleave-Caspase-3蛋白表达水平的影响。结果：1AA-FLS的原代培养及生物学特性1.1AA-FLS的原代培养原代培养所得的细胞经传代纯化后形态规则,呈典型梭形形态,经免疫细胞化学鉴显示细胞vimentin表达呈阳性,CD68表达为阴性,结果表明分离所得为AA-FLS,原代培养成功。1.2 AA-FLS的生物特性(1) AA-FLS的增殖活性：细胞传代培养第1---4d,AA-FLS和正常大鼠FLS均增殖缓慢；细胞传代培养后第4d开始,AA-FLS增殖速度明显高于正常大鼠FLS,差异具有统计学意义(P<0.05),AA-FLS细胞数量倍增所需的时间较正常大鼠FLS短,AA-FLS有较强的增殖活性。(2) AA-FLS细胞的炎性因子表达水平：AA-FLS与正常大鼠FLS相比,TNF-a和IL-1β的表达水平升高(P<0.01)。(3) AA-FLS细胞凋亡率：AA-FLS细胞凋亡呈现明显抑制状态,荧光显微镜下大多数细胞核呈弥散而微弱的蓝色荧光,极少细胞核会出现亮蓝色荧光,此结果表明AA-FLS极少细胞处于凋亡状态。AA-FLS细胞凋亡率低于正常大鼠FLS的细胞凋亡率(P<0.01)。(4) AA-FLS中线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平：AA-FLS中抗凋亡蛋白Bcl-2相对表达量增高,差异有显著性(P<0.01)；促凋亡蛋白Bax的表达量有下调趋势,但差异不具有统计学意义；Pro-Caspase-3的相对表达量有所增高,但是差异无统计学意义,此外本研究发现正常大鼠FLS中并不表达Cleave-Caspase-3 。通过实验结果发现,AA-FLS具有增殖活跃、凋亡抑制和分泌高水平细胞因子的特性。2扁蒴藤素抑制AA大鼠滑膜炎症和滑膜组织增生实验结果显示,低剂量(0.40mg/kg)和高剂量(0.80mg/kg)的扁蒴藤素均能使AA大鼠的足趾容积减小,明显减轻AA大鼠的足肿胀程度而改善病情,扁蒴藤素浓度越高时改善病情效果越明显。大鼠膝关节的病理切片HE染色结果分析表明,低剂量和高剂量组的扁蒴藤素均能阻断AA大鼠滑膜组织的炎性细胞浸润,减少滑膜组织增生。3扁蒴藤素抑制AA-FLS细胞增殖扁蒴藤素能抑制AA-FLS的增殖,扁蒴藤素(0.75μM、1.5μM、3μM、5μM、10μM)作用后的AA-FLS,各组细胞活性显著低于空白对照组(P<0.01)；扁蒴藤素(0.75μM、1.5μM、3μM)干预后的AA-FLS细胞死亡率高于空白对照组细胞(P<0.01)。扁蒴藤素能抑制AA-FLS增殖的作用具有剂量依赖性。4扁蒴藤诱导AA-FLS凋亡Hoechst33258实验结果显示,0.75μM～3μM浓度范围的扁蒴藤素能够诱导AA-FLS凋亡,随着扁蒴藤素浓度的升高,细胞凋亡率也随之升高,与空白对照组细胞相比有显著性差异(P<0.01)。5扁蒴藤素诱导AA-FLS细胞周期G0/G1期阻滞在0.75μM～3μM浓度范围内,扁蒴藤素能使AA-FLS处于G0/G1期的细胞数量增多,处于S期的细胞数量减少,造成细胞周期G0/G1期阻滞。扁蒴藤素浓度越高,阻滞效果越明显。6扁蒴藤素对线粒体凋亡通路相关蛋白的作用对线粒体凋亡通路相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白检测,结果发现,扁蒴藤素能下调Bcl-2的表达,提高Bax的相对表达量,并呈剂量依赖关系。此外扁蒴藤素能促进AA-FLS中的Pro-Caspase-3蛋白剪切活化,增加Cleave-Caspase-3的表达量。提示扁蒴藤素能调节线粒体凋亡通路,从而诱导AA-FLS细胞凋亡。结论：本项研究基于Mtb诱导的AA大鼠模型和AA-FLS细胞模型,通过研究扁蒴藤素对两种模型的作用,评价扁蒴藤素的抗RA作用,阐明相关药理作用机制,通过实验得出以下结论：1.建立了AA-FLS细胞模型,并在细胞模型上观察了细胞增殖和凋亡作用,细胞因子分泌水平等。实验结果表明该细胞模型与RA-FLS具有相似的特点,可以用于RA相关研究中。本实验中探讨扁蒴藤素对RA-FLS的作用是基于AA-FLS细胞模型完成的。2.扁蒴藤素显著抑制AA-FLS增殖,减轻滑膜组织增生,从而达到抗RA的作用。3.扁蒴藤素抑制AA-FLS增殖的主要作用机制是诱导AA-FLS细胞周期的G0/G1期阻滞及诱导AA-FLS细胞凋亡。而扁蒴藤素诱导AA-FLS凋亡是通过调控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达,促进Pro-Caspase-3的剪切,增加促凋亡活性的Cleave-Caspase-3蛋白的表达来实现的。