研究背景和研究目的动脉粥样硬化(AS)是引发人类心脑血管疾病的重要病因,也是全球范围内的研究热点和临床上亟需解决的难题之一。AS是发生于大中型动脉的慢性退行性病变,主要特征为血管内皮功能异常或损伤,伴脂质沉积,多种炎性细胞和炎性因子共同参与,最终导致粥样斑块形成致使动脉管壁硬化,管腔狭窄继而引起靶器官缺血性的改变和相应症状。动脉粥样硬化的机制复杂至今仍未完全阐明。AS的过程始于血管内皮细胞的损伤或功能异常,并在内皮表面黏附分子(E-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1)、趋化因子(MCP-1、IL-8 等)、多种炎症细胞(T淋巴细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等)、炎症因子(IL-1、IL6、TNF-α、CRP、Lp-PLA2 等)和多种基质蛋白酶(MMPs、ASAMTSs、cathepsins等)的共同参与下发生发展。随着脂质核的形成扩大和斑块内炎症反应的加剧,斑块内发生巨噬细胞、平滑肌细胞的凋亡、血管新生、纤维帽和细胞外基质的降解,促进了斑块失稳定性至最终破裂的过程。由此可见,炎症参与并贯穿了斑块发生、发展、去稳定和最终破裂的整个过程。急性冠脉综合征(ACS)是一组因心肌急性缺血所引发的临床综合征,主要包括①不稳定性心绞痛(UAP)、②非ST段抬高型心肌梗死、③ST段抬高型心肌梗死(STEMI)。ACS患者作为冠心病患者中的高危人群,虽然近些年来药物治疗的优化和溶栓介入的开展已经极大地降低了 ACS患者的死亡率,但是其院内和院外发生短期和长期不良心血管事件的风险依然很高,因而对其早期进行风险评估和强化治疗管理在临床上显得尤为重要。GRACE评分和TIMI评分对ACS患者的风险评估已经深入人心,并得到了多项大型临床试验的验证和指南的推荐20 21。GRACE评分主要通过患者的年龄、静息心率、血肌酐水平、收缩压、心衰病史、心肌梗死病史、ST段压低、心肌酶升高、院内是否血运重建这9项指标对ACS患者进行评分。目前的研究表明GRACE评分对ACS患者院内死亡率以及院外的短期预后和长期预后均有较好的预测价值。ACS的病理学基础是冠脉内不稳定斑块的破裂或者发生糜烂后继发血栓形成。不稳定斑块一般伴有如下特点:大量巨噬细胞和炎性细胞浸润,平滑肌成分较少,薄纤维帽(厚度小于65 μm),大坏死核(大于斑块体积的30%),斑块内血管新生和/或斑块内出血,血管扩张性正性重塑,血栓形成。动物模型中常通过计算易损指数来反映斑块的易损性。临床上有多种影像学检查来检测斑块的不稳定性:如多层螺旋CT(MDCT)、光学相干断层扫描技术(OCT)、颈动脉超声和血管内超声(IVUS)。临床上一直以来都将冠脉造影视为冠心病确诊的金标准。通过对造影显示的冠脉内斑块形态的直观观察也可以粗略有效地反应斑块的稳定性。相关研究表明冠脉造影诊断的复杂病变可以较好地反应斑块的易损性并对冠心病患者的预后有独立诊断价值。目前已有多项临床研究通过分析外周血炎症因子的表达与冠脉复杂病变的关系来寻找反映斑块稳定性的血清标志物。Mac-2结合蛋白(M2BP)是一种分泌型的高度糖基化蛋白,也是巨噬细胞清道夫受体富含半胱氨酸域超家族成员之一。M2BP在造血细胞和上皮细胞中表达,多种其他组织也可以表达M2BP,例如结肠组织、十二指肠、胃组织和肺脏,并且在人体的多种体液中也可以检测到M2BP的存在,例如精液、尿液、泪液、乳汁和血浆。M2BP作为一种致炎性蛋白在肿瘤和病毒感染时表达增高并被多项研究证实与肿瘤的转移和预后密切相关。近年来的研究表明M2BP可以激活人单核细胞并上调炎症因子的表达,参与了机体的细胞免疫应答。并且研究发现相较于健康个体,M2BP的血浆水平在冠心病患者中是显著升高的,且和冠心病危险因素、机体的代谢、氧化应激水平密切相关。一项最新的研究证实了 M2BP在人体冠脉斑块中与CD68阳性的巨噬细胞共表达并且在致炎性的M1性巨噬细胞中高表达。另外,一项回顾性研究表明M2BP对冠脉CT诊断的149名冠心病患者的长期死亡率有独立预测价值。鉴于M2BP的炎性特征以及其在动脉硬化和冠心病领域的相关研究,我们猜测M2BP参与了动脉硬化和斑块去稳定性的过程。后续的研究中我们将通过临床观察与基础研究相结合的方式深入地探讨M2BP在动脉硬化和斑块去稳定性中的作用及相关机制,进而为冠心病的病理机制提供新的理论依据和治疗靶点。研究内容1.比较M2BP在冠心病患者(ACS、SAP)和对照组(control)外周血中的表达,同时分析其表达水平与冠脉复杂病变的相关性,并且探讨血浆M2BP水平在ACS患者中的预后价值。2.分析比较M2BP在冠心病患者(ACS、SAP)和对照组(control)外周血单个核细胞(PBMC)中的mRNA表达差异及与多种炎症因子表达的相关性,最后分析M2BP在PBMC中表达水平对冠脉复杂病变的诊断价值。3.连续入选51名颈动脉内膜切除患者,结合患者症状和颈动脉超声情况,分析M2BP在症状性患者和不稳定斑块内的表达。4.体内动物实验通过慢病毒载体介导M2BP的沉默,观察M2BP沉默对ApoE敲除小鼠斑块形成和斑块内成分的影响。5.体外细胞实验通过重组蛋白刺激探讨M2BP对THP-1和HUVEC细胞内炎症因子的调控及相关机制。研究方法1.M2BP在冠心病患者外周血的表达及其在ACS患者中预后价值研究连续入选从2015年1月到12月入住我院接受冠脉造影的患者共348名,其中包括急性冠脉综合征(ACS)患者216名,稳定型心绞痛(SAP)患者82名,还有对照组(controls)50名。入院后常规采集病史并静脉采集外周血离心后取上清用于M2BP的Elisa检测。由我院心内科专家分析患者的冠脉造影的靶血管造影形态和管腔狭窄程度,按照Ambrose’s分类法分为简单病变和复杂病变。并随机选取SAP病人30名于术前和术后多个时间点(1h、2h、6h和24h)采静脉血用于M2BP的检测。对ACS患者,入院即进行GRACE评分和危险分层,并随访一年。随访终点事件为复合终点(major adverse cardiovascular outcomes,MACE),包括心源性死亡,非致死性心肌梗死,再发心绞痛入院。建立Cox多因素模型筛选ACS患者预后的独立危险因素。2.M2BP在冠心病患者外周血单个核细胞中的表达及对复杂斑块的预测价值研究随机入选从2016年1月到3月入住我院接受冠脉造影患者共60名,其中包括急性冠脉综合征(ACS)患者40名,稳定型心绞痛(SAP)患者20名,另匹配健康对照组(controls)10名。入院后常规采集病史并抽取外周血Elisa检测炎症因子(hs-CRP、IL-6、TNF-α)表达,Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)并RT-PCR检测M2BP和其他炎症因子的mRNA表达水平。通过造影分析按照Ambrose’s分类法分为简单病变和复杂病变。所有患者出院后一个月门诊随访时抽取外周血提取PBMC做M2BP的RT-PCR检测与入院时比较。建立Logistic多因素模型和ROC曲线判断M2BP在PBMC中的mRNA表达对冠脉复杂病变的预测价值。3.M2BP在人体颈动脉斑块中的表达及其与斑块去稳定性的相关研究连续入选我院接受颈动脉内膜切除术的患者共51名,根据其近6个月来有无缺血症状(脑卒中stroke、短暂性脑缺血发作TIA和一过性黑矇amaurosis fugax)分为症状性斑块和无症状性斑块。根据颈动脉超声分为无回声斑块、异质性斑块和强回声斑块。患者入院后常规集病史并抽取外周血Elisa检测M2BP。切除的颈动脉斑块部分用于M2BP的RT-PCR检测,部分用于免疫组化染色(M2BP、CD68 和 α-smooth muscle actin)和 Masson 染色。Image pro plus 软件分析阳性染色面积。从外周血、斑块内mRNA表达和斑块内染色面积三个水平分析比较M2BP的表达与超声、症状、斑块内成分的关系。4.M2BP对斑块形成和稳定性的影响及其炎性调控机制的基础研究4.1 M2BP对斑块形成和稳定性影响的体内研究60只8周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养2周后过渡到高脂饮食,高脂喂养8周后,将小鼠随机分为三组①PBS对照组(阴性对照组,n=20,尾静脉注入200ul的PBS)②空载体对照组(Lenti-null组,n=20,尾静脉注射200ul含有107TU的空载体慢病毒)③慢病毒沉默组(Lenti-M2BP组,n=20,尾静脉注射200ul含有107TU的M2BP沉默慢病毒)。注射完慢病毒后所有小鼠继续高脂喂养4周后麻醉处死。眼球取血后离心分离上清用于血脂和M2BP的Elisa检测。小鼠心脏浸泡于4%多聚甲醛过夜后部分OCT包埋制作冰冻切片用于主动脉根部油红染色,部分石蜡包埋制作石蜡切片,用于主动脉根部HE、天狼猩红和免疫组化染色(α-SMC、CD68、IL-6、MCP-1、ICAM-1、Lp-PLA2、MMP2、MMP9)。自升主动脉致腹主动脉分离主动脉全长,部分用于Western Blot和RT-PCR,部分用于大体油红0染色。Image pro plus软件分析比较各组小鼠染色面积,计算斑块的易损指数。4.2 M2BP炎性调控机制的体外研究1)以 不 同浓度的 ox-LDL(0、10、20、40、80μg/ml)刺激 THP-1 细胞 6 小时和24小时,取上清用于M2BP的Elisa检测。2)以 不同的炎症因子(ox-LDL20μg/ml、IL-1β10ng/ml、TNF-α10ng/ml)单一刺激或联合刺激THP-1细胞6小时和24小时,取上清用于M2BP的El isa检测。3)以不同的炎症因子(ox-LDL20μg/ml、IL-1β1Ong/ml、TNF-α 10ng/ml)单一刺激或联合刺激HUVEC细胞24小时,取上清用于M2BP的Elisa检测。4)以不同浓度的 rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激 THP-1 细胞 6 小时和24小时,Elisa检测培养基中炎症因子IL-6,IL-8,TNF-α,MMP-9,Lp-PLA2的表达。5)分别以不同浓度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5 u g/ml)刺激HUVEC细胞24小时,elisa检测培养基中IL-8和MCP-1的表达。6)分别以不同浓度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激HUVEC细胞6小时,Western blot 检测黏附分子ICAM-1、VCAM-1 和 E-selectin 的表达。7)细胞黏附实验检测不同浓度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激对THP-1细胞与HUVEC细胞的黏附作用的影响。8)Transwell趋化实验检测不同浓度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5 μ g/ml)刺激对THP-1细胞趋化作用的影响9)研究重组蛋白rhM2BP刺激对THP-1细胞内MMP9和MMP2表达和活性的时间依赖性和浓度依赖性的影响并通过相应的通路抑制剂预刺激研究NF-kB和MAPK信号通路是否参与了 rhM2BP对MMP9和MMP2的调控。研究结果1.M2BP在冠心病患者外周血的表达及其在ACS患者中预后价值研究相比于对照组,SAP组和ACS组的患者有更多的冠心病危险因素(吸烟、糖尿病、高脂血症)。CAD组患者M2BP水平明显高于Control组的患者(p<0.0.01),UAP组患者外周血M2BP水平明显高于SAP组和Control组(p<0.001),而在ACS患者中,NSTEMI、STEMI患者的M2BP水平与UAP组患者相比并没有显著统计学差异。Spearman相关性分析发现ACS患者外周血M2BP水平与hs-TnT没有显著的相关性(r=0.081,p=0.240)。而在ACS患者中,外周血的M2BP水平与GRACE评分具有良好的相关性(r=0.218,p=0.001),并且与GRACE评分危险分层呈正相关。SAP患者PCI术后1小时外周血M2BP显著升高,后逐渐下降,24h下降至基线水平。CAD患者外周血M2BP水平与冠脉病变支数无明显相关性。而通过对ACS患者冠脉造影的分析我们发现,其外周血M2BP的水平与冠脉复杂病变的支数(程度)成正相关(p<0.001)。在对216名ACS患者为期1年(11.7±2.7months)的随访中,共发生了 45(20.8%)例MACE事件。事件组的ACS患者外周血M2BP显著高于非事件组患者(p<0.001)。Cox多因素模型在调整了其他临床危险因素后,M2BP对ACS患者的预后仍然有独立预测价值。并且血浆M2BP联合GRACE评分能提高对ACS患者预后的诊断价值。2.M2BP在冠心病患者外周血单个核细胞中的表达及对复杂斑块的预测价值研究ACS患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表达显著高于SAP和Control组(p<0.001),并且在急性期表达水平明显高于慢性稳定期(p<0.001)。Spearman相关性分析显示:冠心病患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表达与外周血血浆中炎症因子的表达以及外周血PBMC中炎症因子的mRNA表达呈显著正相关。冠脉复杂病变(n=48)的CAD患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表达显著高于冠脉简单病变(n=12)的CAD患者(p=0.004)。并且CAD患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表达与冠脉复杂病变的数目有明显的相关性。ROC曲线分析示在本研究队列中,PBMC中M2BP的mRNA表达水平对复杂病变的诊断价值明显高于血浆hs-CRP(曲线下面积AUC:0.696 vs 0.588,p=0.109)。Logistic多因素分析在进行多个危险因素的调整后,PBMC中的M2BP的mRNA表达仍然对冠脉复杂病变有独立预测价值(OR=2.586,95%CI=1.124-5.948,p=0.025).3.M2BP在人体颈动脉斑块中的表达及其与斑块去稳定性的相关研究M2BP在颈动脉斑块内的细胞核、细胞质和细胞外间质中均有表达,且作为分泌性因子其主要分布于细胞外间质。连续切片免疫组化染色显示M2BP在人体颈动脉斑块内与巨噬细胞共定位表达,而在平滑肌细胞中几乎不表达。M2BP在破裂的Ⅲ型斑块中和拥有脂质核的Ⅱ型斑块中是高表达的,在Ⅰ型纤维斑块中是低表达的。并且M2BP在斑块肩部、坏死核内、破裂的纤维帽部位这些易损位点均是高表达的,在完整的纤维帽上和斑块内的纤维组织中是弱表达的。M2BP在症状性患者中表达高于无症状性患者,并且随着最近发作的症状发生时间的增加其表达水平呈现下降趋势。另外,其在TIA和stroke患者中表达高于在黑矇患者中的表达,在无回声斑块和异质性回声斑块中的表达高于强回声斑块中的表达。Spearman相关性分析示:M2BP的阳性染色面积与CD68巨噬细胞阳性染色面积成正比(p=0.374,r=0.007),与TUNEL阳性染色面积成正比(r=0.329,p=0.018),与平滑肌SMC阳性染色面积(r=-0.309,p=0.027)以及胶原染色面积(r=-0.304,p=0.030)成反比。4.M2BP对斑块形成和稳定性的影响及其炎性调控机制的基础研究4.1 M2BP对斑块形成和稳定性影响的体内研究实验完成时三组小鼠的体重和血脂含量(总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇)无显著差异。慢病毒转染后血清Elisa显示lent i-M2BP组M2BP水平相比于空病毒组和PBS组明显降低(p<0.05)。免疫组化、Western blot和RT-PCR显示lenti-M2BP组M2BP的蛋白和基因表达水平相比于空病毒组和PBS组明显降低(p<0.05)。大体油红0染色和主动脉根部HE染色示lenti-M2BP组的主动脉AS病变范围和主动脉根部AS病变面积显著降低。Lent i-M2BP组的巨噬细胞和脂质成分明显低于Lenti-nu]]和PBS组,而平滑肌和胶原成分明显高于Lenti-null和PBS组,易损指数明显低于Lenti-null和PBS组。免疫组化和RT-PCR分析显示:Lenti-M2BP组的黏附分子(ICAM 1)、炎症因子(IL-6、MCP-1、Lp-PLA2)、基质蛋白酶(MMP9和MMP2)水平和血管新生(CD31、VEGFA、Flt-1)明显低于 Lenti-null 和 PBS 组。4.2 M2BP炎性调控机制的体外研究Ox-LDL能够浓度依赖和时间依赖性地上调THP-1细胞内M2BP的表达。多种炎症因子(ox-LDL 20μg/ml、IL-1β10ng/ml、TNF-α1Ong/ml)可以浓度依赖和时间依赖性地上调THP-1细胞内M2BP的表达并呈现叠加增强效应。同时,它们也可以刺激HUVEC细胞上调M2BP的合成分泌并呈现叠加效应。而重组蛋白rhM2BP又可以浓度依赖和时间依赖性地刺激THP-1细胞分泌多种炎症因子(IL-6,IL-8,TNF-α,MMP-9,Lp-PLA2),并且重组蛋白rhM2BP可以浓度依赖性地促进HUVEC细胞分泌趋化因子(IL-8和MCP-1)并上调表面黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和E-selectin)的表达。另外,rhM2BP刺激可以促进THP-1单核细胞与HUVEC细胞的黏附,还可以促进THP-1细胞的趋化。重组蛋白rhM2BP可以浓度依赖性和时间依赖性地上调THP-1细胞内MMP9和MMP2的表达和活性。并且2ug/ml的rhM2BP刺激THP-1细胞1h即可促使NF-kB p65和MAPK(ERK、P38和JNK)信号通路分子显著磷酸化激活。而给予NF-kB p65和MAPK通路抑制剂预刺激1h后再给予rhM2BP刺激24h可以显著下调MMP9和MMP2的表达和活性。结论:(1)M2BP在ACS患者的外周血中高表达并与冠脉复杂病变相关;外周血M2BP的水平对ACS患者的预后有独立预测价值;M2BP联合GRACE评分可以提高其对ACS的预后诊断价值。(2)PBMC是外周血M2BP的重要细胞学来源,ACS患者的PBMC中M2BP的mRNA表达水平明显升高且对冠脉复杂病变有良好的诊断价值和独立预测价值。(3)M2BP在不稳定颈动脉斑块和斑块内的易损位点是高表达的,并且与临床缺血症状显著相关,提示M2BP参与了颈动脉斑块去稳定性的过程。(4)M2BP受炎症因子的调控,并可以通过上调单核巨噬细胞内炎症因子的合成分泌、上调血管内皮细胞表面黏附分子的表达和趋化因子的合成分泌、促进单核细胞的趋化迁移及其与血管内皮细胞的黏附、参与斑块内的血管新生等机制促进动脉粥样硬化的发展和斑块的去稳定性。(5)M2BP通过激活细胞内NF-kB p65和MAPK(P38、ERK和JNK)信号通路上调单核巨噬细胞MMP2和MMP9的表达促进胶原的降解进而促进斑块的易损性。