论文部分内容阅读
目的： 1.收集原发性高血压(Essential Hypertension，EH)患者的临床资料及外周血样本，建立EH患者临床资料数据库及线粒体基因组遗传数据库。 2.开展EH患者线粒体ND6基因变异筛查，绘制ND6基因的突变谱。 3.分析EH的发生发展与线粒体ND6基因变异的相关性。 方法： 1.根据2010年版《中国高血压防治指南》EH的诊断标准，选取中国汉族人群中无血缘关系的1195例EH患者为病例组;443例健康人群为对照组，共1638例，收集相应临床资料及外周血样本。 2.提取1638例受试对象的外周血全基因组DNA。 3.采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)对线粒体ND6基因片段进行特异性的扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，然后对相应片段进行DNA测序并分析。 4.使用Codoncode aligner、Chromas和DNA star3种生物信息分析软件将ND6基因片段的测序结果与最新的剑桥参考序列(revised Cambridge ReferenceSequence，rCRS)比对，进而分析线粒体ND6基因变异数据，并对结果进行统计学分析。 5.使用Clustal X软件和对应蛋白质数据资源库，分析病例组线粒体ND6基因所携带的基因变异位点在14个灵长类物种间的保守性系数(ConservationIndex，CI)和对应氨基酸的改变情况。 6.使用SOSUI在线分析软件，分析蛋白质二级结构的改变情况，并统计分析线粒体ND6基因变异与EH的相关性。 结果： 1.病例组与对照组的临床资料统计分析结果显示，两组的性别构成无显著性差异(表8，P值=0.918＞0.05)。 2.病例组1级高血压患者携带ND6基因变异与对照组存在统计学差异(表11，x2为7.281，P值=0.007＜0.05)。病例组2级高血压患者携带ND6基因变异与对照组存在统计学差异(表11，x2为10.723，P值=0.001＜0.05)。2级高血压受试样本两组间携带≥2个线粒体ND6基因变异的情况存在明显差异(表12，x2为5.101，P值=0.024＜0.05)。 3.将不同年龄段的受试样本的基因变异携带情况进行统计分析，结果发现1级高血压49～58岁组(表13，x2为5.277，P值=0.022＜0.05)，2级高血压39～48岁组和59～68岁组两组间分别存在统计学意义(表13，x2为14.895，P值=0.000＜0.05; x2为5.104，P值=0.024＜0.05)。 4.PCR扩增1195例病例组和443例对照组的线粒体ND6基因，测序分析后显示病例组有476例样本携带线粒体ND6基因变异，对照组有176例样本携带线粒体ND6基因变异。 5.病例组筛查线粒体ND6基因共有66个变异，其中基因变异频率为13.75×10-2/bp(66/480bp);对照组共有40个变异，基因变异频率为8.33×10-2/bp(40/480bp);病例组与对照组共筛查到基因变异74个。经x2检验，结果显示病例组和对照组的线粒体ND6基因变异发生频率存在显著差异(表14，P值=0.008＜0.05)。 6.病例组ND6基因变异中有20个错义突变，46个同义突变;对照组则有11个错义突变，29个同义突变。 7.病例组携带46个同义突变，占69.70％，其中35个基因变异CI≥78％，其病例组总变异频率为17.41％，且35个CI≥78％的基因变异中，对照组14个变异未发现，而病例组总变异频率为1.81％。病例组携带的46个同义突变中，存在3个基因变异ND6A14320G、A14617G和C14671T在MITOMAP数据资料库中未报道，且这3个变异的CI均≥78％，其中ND6 A14320G位于基质区，ND6 A14617G和C14671T位于跨膜区，而且A14320G和C14671T在对照组中未发现。 8.病例组携带20个错义突变，占30.30％，其中5个基因变异CI≥78％。这5个高度保守的错义突变中，14496位点的CI为100％，在MITOMAP数据库未报道过;14598位点的CI也为100％，此基因变异在对照组和MITOMAP2704例数据库中未发现。病例组携带的20个错义突变中，10个错义突变对照组中未发现，其病例组总变异频率为17.41％，且ND6 G14226A的二级结构预测发生了改变，病例组变异频率为0.25％。 9.在ND6蛋白质的二级结构上，基质区存在21个基因变异，包括10个错义突变，占13.51％，11个同义突变，占14.86％;跨膜区存在45个基因变异，包括11个错义突变，占14.86％，34个同义突变，占45.95％;膜间区存在8个同义突变，占10.81％。 10.ND6蛋白质的二级结构预测，发现3个错义突变ND6 G14226A，T14318C和C14340T导致ND6亚基的二级结构改变，其中ND6 G14226A位于第5跨膜区，ND6 T14318C和C14340T位于基质区，而且ND6G14226A在对照组未发现。当携带ND6G14226A时，第5跨膜区的N端由145位变为150位，C端由167位变为171，其长度由23个氨基酸缩短为22个。当携带ND6T14318C时，增加了1个跨膜区，增加的跨膜区为N端109位到C端131位，共23个氨基酸。当携带ND6 C14340T时，第4跨膜区的C端由106位变为105位，长度缩短了一个氨基酸。 结论： 1.1638例受试样本中，线粒体ND6携带了大量基因变异，大部分可能为线粒体DNA多态性位点，但是ND6基因G14207A、G14226A、G14258A、C14272G、 A14280G、T14318C、T14319C、T14325C、C14334T、 C14337T、C14340T、G14364A、A14496G、T14502C、T14550C及T14598C基因变异可能提高了EH患病的易感性。 2.线粒体ND6C14272G，A14496G和T14598C，CI≥78％，在对照组中未发现，且ND6A14496G在MITOMAP数据库中未报道。当携带上述3个基因变异时，可能引发线粒体呼吸功能障碍，产生氧化应激作用，从而参与疾病的发生发展。