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随着自由基学说的发展和活性氧影响研究的深入,在食品、医药、化妆品和饲料等行业迫切地需要安全、天然、高效的抗氧化产品来替代具有潜在危害的传统合成抗氧化剂,蛋白肽是其中前景十分广阔的一种。乳清蛋白作为优质的蛋白资源,已开发出多种生物活性肽产品。近年来研究发现,乳清蛋白中存在着抗氧化活性序列,然而研究多集中于酶解工艺的优化和初步的纯化过程。本论文通过对乳清蛋白酶解、纯化、测序得到活性肽段,并对产物特性进行研究,以提升乳清蛋白的生理活性和功能特性,扩大乳制品及其副产物应用范围,为抗氧化肽结构特性和作用机理的研究提供借鉴。本论文首先通过单因素试验,响应面回归分析得到乳清蛋白酶解的最佳工艺为:以胰蛋白酶为酶源,乳清蛋白30 mg/mL、水解时间90 min、温度50℃、酶底物比2%(w/w)、pH 7.6。最优酶解条件下,水解度约为19%,10 mg/mL酶解产物的DPPH自由基清除率为78.78%,显示出较好的抗氧化活性。酶解产物相对分子质量主要集中于185~2632 Da,清除DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子的IC50分别为5.52 mg/mL、6.25 mg/mL、7.16 mg/mL,且具有很高的还原力。酶解产物经肠胃消化酶作用后DPPH自由基清除活性仅下降5%。在pH5~7下具有较高的DPPH自由基清除活性,沸水浴处理30 min仍能保持70%,在冷冻下储藏3个月DPPH自由基清除活性下降约12%。采用DA201-C大孔吸附树脂,60%乙醇洗脱,对乳清蛋白酶解后产物进行初步纯化,吸附率为78.80%,吸附量为31.16 mg/g,解吸率为96.24%,回收率为75.86%,IC50为4.33 mg/mL。依次采用凝胶过滤色谱Sephadex G-15、制备型RP-HPLC和分析型RP-HPLC对大孔纯化产物进行分离,最后得到两个肽段A3a和A3b,IC50分别为0.00251 mg/mL和0.00495 mg/mL。经Q-TOF MS分析得A3a中母离子m/z 1568.70氨基酸序列为LDGNAKPTPEGDLEL,A3b中母离子m/z 1731.70氨基酸序列为LYEDLKPTPEGPME L。本文研究结果表明,乳清蛋白酶解产物具有良好的耐消化、耐热耐酸碱和耐储藏稳定性,分离纯化得到两个肽段抗氧化活性较好,适宜作为保健食品和食品添加剂。