研究背景:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见自身免疫性疾病,其病理特征主要表现为关节滑膜炎症、炎性细胞浸润、滑膜成纤维状细胞(RA synovial fibroblast-like cell,RASF)异常增殖、血管翳形成以及关节软骨和骨组织损伤等。由于目前对RA病理机制尚不完全清楚,所以治疗该病的药物有限,主要是通过非甾体抗炎药物如阿司匹林和吲哚美辛、抗风湿药物(Disease-Modifying Anti-rheumatic Drug,DMARD)如甲氨蝶吟(methotrexate,MTX)和生物制剂如英夫利昔单抗(infliximab)和利妥昔单抗(rituximab)来抑制该病炎症和自我免疫。最新研究表明,RA治疗的锚定药物甲氨蝶呤可通过恢复调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)细胞的数目和功能来达到缓解RA的目的。虽然关于类风湿性关节炎患者外周血中调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)表型和绝对数量的数据存在争议,但更多的报道提示Treg的缺陷与RA中免疫细胞的失衡与异常激活激活有关。因此,筛选具有升高Treg细胞比例和功能的药物,可能是开发治疗RA新药的关键。CD38作为一种环腺苷二磷酸核糖水解酶(Cyclic ADP Ribose Hydrolase,cADPRH)可以代谢胞外烟酰胺二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,辅酶I,NAD+),产生腺苷二磷酸核糖(ADPR)和环状腺苷二磷酸核糖(Cyclic ADP Ribose,cADPR)。cADPR和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)是两种结构不同的信使,它们分别动员胞内质和溶酶体内钙离子(Ca2+)储存。因此,CD38通过控制细胞外核苷酸稳态和细胞内钙流量参与多种生理、病理活动,如感染、肿瘤、免疫和衰老等。我们前期通过寡核苷酸芯片(oligonucleotide microarrays,Illumina Human HT-12 v4表达组芯片),实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)和免疫组化方法(Immunohistochemistry)发现与骨关节炎(osteoarthritis,OA)(n=40)和强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)(n=27)滑膜相比,CD38在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)(n=42)滑膜组织中特异性高表达。有人利用CD38敲除小鼠制备牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎(Collagen-Induced Arthritic,CIA)模型,发现CD38敲除后可以明显缓解CIA的发生和发展。这些结果建议CD38对RA的重要作用和作为治疗靶点的可能性。我们前期通过流式细胞术检测还发现CD38(+)CD56(+)细胞在RA外周血(n=103)中比例显著升高,且与临床表现正相关。CD56是自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)重要的标志物。NK细胞是人体重要的免疫细胞。与肿瘤和感染密切相关。如NK细胞即可通过直接接触杀伤又可通过抑制调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的分化和功能抑制肿瘤进展。NK细胞与类风湿性关节炎密切相关。如NK细胞既可以通过调节骨代谢,介导骨侵蚀,又可以通过影响分泌TNF-α、IFN-γ等细胞因子调节B、T、巨噬细胞等免疫细胞或成纤维细胞的活性和功能间接或者直接参与RA的进程。众所周知,CD38在促进NK细胞的活化中发挥重要作用。有研究者报道,CD38(+)CD56(bright)CD16(-)NK通过抑制CD4(+)T细胞的增殖,参与类风湿性关节炎的进展。这些结果提示CD38(+)NK细胞对RA的重要作用和作为治疗靶点的可能性。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷通常为氯化矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Kuromanin Chloride,Cyanidin-3-O-glucoside Chloride,1-Benzopyrylium,5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-(β--D-glucopyranosyloxy)-,chloride,C3G),其分子式为C21H21C1011,结构母核为2-苯基苯并吡喃阳离子,属于类黄酮化合物。据报道,C3G具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化药物作用。研究发现,C3G也是CD38的抑制剂,可通过与CD38活性部位结合,竞争性抑制CD38的功能。因此,我们推断C3G具有治疗RA的可能性。本研究以牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠(Collagen-Induced Arthritic,CIA)和体外培养的RA滑膜成纤维细胞(RA synovial fibroblast-like cells,RASFs)、RA滑液和健康人外周血单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)为模型,探索C3G对RA潜在的作用及机制。方法:本研究计划用C3G处理CIA大鼠,观察处理后大鼠关节炎症、关节组织病理、外周血和关节滑液中各淋巴细胞亚型及炎性因子的变化。本研究也用C3G刺激体外培养的RASF,观察处理后RASF细胞增殖、凋亡、细胞周期以及RASF培养液中各炎性因子分泌的变化。本研究还计划探索CD38参与RA和C3G治疗RA的细胞免疫学机制和分子通路。我们用C3G孵育外周血或RA关节滑液来源的MNCs,观察共培养后各淋巴细胞亚型和各炎性因子的变化。基于上述观察结果,本研究重点分析CD38(+)NK细胞和Treg细胞的变化。我们用C3G直接培养NK细胞、MNC和Treg细胞,观察C3G是否直接作用这些细胞,以及NK细胞中cADPR和Ca2+的相对含量及CD38基因表达。也基于上述观察结果,本研究将CD38(+)NK细胞与MNC细胞共培养,重点观察CD38(+)NK诱导MNC分化Treg细胞的机制。结果:1.C3G对CIA大鼠病程的作用。我们以CIA大鼠作为RA的动物模型,用C3G治疗CIA大鼠后,用流式细胞技术分析CIA大鼠外周血、关节滑液中各细胞亚型和细胞因子。结果表明,C3G注射后大鼠CIA有明显缓解,而且外周血和关节滑液中炎症因子IL-6和IFN-r浓度降低,抑炎因子IL-10水平升高。C3G注射可升高CIA大鼠外周血和滑液中Treg细胞的比例、降低CD38(+)NK细胞比例下降。这些结果说明,C3G对RA和CIA有治疗作用。2.C3G对RA滑膜成纤维细胞增殖、凋亡作用。我们以RASF细胞作为RA的体外模型,用C3G处理后的RASF增殖能力降低,细胞凋亡水平升高,培养液中IL-6分泌水平也降低。3.C3G对外周血和滑液中单个核细胞作用。我们以外周血和滑液来源的MNC细胞作为RA的体外模型,用C3G分别培养外周血和RA滑液来源的MNC,发现C3G可以降低MNC中CD38(+)NK细胞比例,升高Treg细胞及IL-10(+)Treg细胞比例。C3G同时提升MNC培养液中IL-2和IL-10分泌,降低IL-6和IFN-r分泌。4.C3G对Treg细胞和NK细胞作用。为了探索C3G诱导Treg细胞比例的分子机制,(1)我们用C3G培养Treg细胞,发现C3G不直接影响Treg细胞增殖和分泌IL-10。(2)我们用C3G刺激NK细胞后和Treg细胞共培养,发现NK细胞降低MNC中Treg细胞和IL-10(+)Treg细胞比例。C3G通过NK细胞提高Treg细胞的比例和IL-10分泌功能。(3)我们用C3G培养NK细胞,发现C3G可降低NK细胞中CD38的mRNA和蛋白水平的表达,同时降低培养液中cADPR和Ca2+的浓度。这些结果说明,C3G也有效的抑制CD38的表达和活性。以上结果提示,C3G可能通过影响CD38(+)NK细胞影响Treg细胞和IL-10分泌功能。5.C3G处理后的CD38(+)NK细胞对MNC作用。为了验证以上猜想,我们用C3G培养去除CD38(+)NK的MNC,发现C3G不影响MNC中Treg细胞的比例及细胞因子分泌水平。与C3G处理的CD38(+)NK共培养后MNC中Treg细胞比例升高,IL-6和IFN-γ的浓度降低,IL-10的浓度升高。以上结果提示,C3G通过降低CD38(+)NK细胞比例去提升MNC中Treg细胞的比例,从而增加IL-10分泌和降低IL-6和IFN-r水平。6.Sirt 6对CD38(+)NK细胞分泌功能的影响。为了探究C3G对CD38(+)NK细胞分泌功能的影响及机制。我们C3G处理CD38(+)NK细胞后,(1)WB和real-time PCR结果表明C3G升高Sirt 6基因表达水平和降低NKG2D表达水平。(2)流式结果表明,C3G处理后CD38(+)NK培养液中TNF-α的浓度升高,IFN-γ的浓度降低。(3)为了验证TNF-α、IFN-γ在Treg细胞分化中的作用,我们分别用TNF-α、IFN-γ、anti-IFN-γ抗体和anti-TNF-α抗体加入到CD38(+)NK与去除CD38(+)的MNC培养体系中,实验表明TNF-α促进C3G处理的CD38(+)NK细胞提升MNC中IL-10(+)Treg细胞比例,IFN-γ促进C3G处理的CD38(+)NK细胞降低MNC中IL-10(+)Treg细胞比例。(4)为了探究Sirt6对CD38(+)NK分泌功能的影响,我们将去除CD38(+)NK的MNC与Sirt 6 siRNA转染后的CD38(+)NK细胞共培养,结果提示,CD38(+)NK细胞通过Sirt 6基因表达抑制TNF-a和IFN-r分泌。以上结果表明,C3G通过促进CD38(+)NK细胞中Sirt 6表达,影响CD38(+)NK细胞分泌功能。7.Sirt 6抑制剂对大鼠CIA作用。为了明确Sirt6在C3G治疗RA中发挥的重要作用,我们用C3G联合Sirt 6抑制剂注射CIA大鼠发现CIA大鼠足趾仍然肿胀,Treg细胞比例仍较低。与C3G处理的对照组相比,C3G联合Sirt 6抑制剂处理后CIA大鼠足趾炎症明显升高。与CIA对照组相比,C3G处理后CIA大鼠和C3G联合Sirt 6抑制剂处理CD38(+)NK 比例均下降,而且二者无明显差异。这些结果证明Sirt 6抑制剂不影响CD38(+)NK数量,而可能是通过改变其功能降低Treg细胞比例来阻止C3G对CIA的治疗作用。结论:C3G对CIA和RA有治疗作用。C3G处理抑制CD38+NK细胞比例、RASF增殖和促炎细胞因子分泌,但增加Treg细胞比例。C3G在CD38+NK细胞内提高Sirt6的表达和抑制NKG2D的表达并刺激TNF-α的分泌、减少IFN-γ的分泌,结果刺激MNC分化为Treg细胞。上述发现为C3G作为治疗RA药物应用于临床提供了理论依据。