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前言 吲哚美辛(indomethacin IN)为镇痛作用较好的非甾体(NSAIDS)抗炎免疫药,长期用于缓解风湿性疾病和治疗多种关节炎。近年来发现其有抑制肿瘤生长作用,而受到国内外专家的重视,但其对肿瘤及宿主作用机制尚不十分清楚。本研究首次使用不改变药物分子结构的放射性核素示踪剂“氚”标记吲哚美辛(~3H-IN),将其引入荷瘤鼠体内,应用放射自显影和液闪测量技术观测吲哚美辛在荷瘤鼠体内的分布情况及其亲肿瘤性的强弱,并探讨IN的抗肿瘤机制,现将研究结果介绍如下。 实验材料 1.鼠Lewis肺癌模型:将荷瘤鼠处死,取生长良好的肿瘤组织5克,磨碎,加生理盐水15ml稀释。接种于C57BL/6近交系小鼠右前腋部皮下,待接种部位肿瘤长至长径为0.8-1.0cm时备用。 2.氚标记吲哚美辛:用同位素交换法进行氚标记吲哚美辛,放化纯>95%;比活度>185MBq/mg,由中科院北京原子能所氚标记实验室完成。 3.闪烁液:取2.5二苯基恶唑(ppo)4g(香港),1.4双[2-(5-苯基恶唑)]-苯(popop)100mg(德国),萘60g溶于1000mlAR级二甲苯中,再加无水乙醇570ml,充分混匀;将此闪烁液加入到液闪瓶中(10ml/瓶),放入Beckmen全自动液闪测定仪(美国)测定本底,cpm<50为合格待用。 4.原子核液体乳胶(核-40型):北京原子能院物理研究所生产;显影液(D-19b)、定影液(F-5),均为上海感光材料厂生产;乳胶涂布箱为北京医科大学电子仪器厂制造。 实验方法 1.动物分组:将25只荷瘤鼠分成5组,每组5只;5组时间分别为服药后2 .sh,4h,7h,12h,24h。 2.场C:按185KB丫只(0.Zlnl)含有IN125卜g灌胃,于给药后2.sh,4h,7h,12h,24h分别处理各组动物。先摘眼球取血,测其放射性计数,之后处死小鼠,取肝、肾、肌肉、脂肪、肿瘤组织用生理盐水洗净表面浮血,滤纸吸干称湿重。分别匀浆后均匀平铺于滤过膜上晾干,放人液闪瓶内测定放射性cPm数,再求得每克组织cPm。并计算每克脏器或组织的放射性占服药总剂量的百分数以及瘤与其他组织脏器的放射性比值。 3.ARG制作:在进行荷瘤组液闪测量取材的同时,再分别另取一块瘤组织制成7协m的标本切片。在暗室内,将切片均匀涂抹上液体乳胶,晾干置于暗盒中,加硅胶干燥袋密封,置4℃冰箱中曝光Zld。曝光结束后取出置于显影液中显影4而n,充分水洗,再放人定影液中定影10而n,清水冲洗,HE染色后封片,镜下观察肿瘤细胞中银颗粒分布状况。 所有计量资料结果以又士s表示,两样本均数比较采用t检验。检验水准P=0.01,P<0.05为显著;P<0.01为极显著。实验结果 3H一IN能够选择性浓聚于肿瘤组织,巧CT表明2.5h时每克瘤组织的放射性占服药总剂量的百分数值就开始高于肌肉和血液,4h达最大值,此后其清除速率明显慢于其他各脏器。给药后7h每克瘤组织的放射性占服药总剂量的百分数值与肌肉、脂肪、血液相比有显著性差异(P<0.05),在12h肿瘤与其他组织脏器(除肝、肾外)的每克组织的放射性占服药总剂量的百分数值之间的差异有极显著性(P<0.01)。肿瘤与肌肉、脂肪、血液的放射性比值随时间延长而逐渐增加,给药后12h达最高值:瘤/血、瘤/肝、瘤/肾、瘤/肌、瘤/脂,分别为4.85土2.14、1.54土0.35、0.93土0.38、3.61土1.34、2.61士0.78。观察ARG片子发现,肿瘤细胞的胞浆及胞核均有黑色的银颗粒分布,并且在胞浆中分布的数量多于胞核,在用药后12h时肿瘤组织ARG中的平均银颗粒数目要高于7h、24h、4h、2 .sh,这和液闪测量的结果相一致(图l、图2)。讨论 早在1973,stoll等人就发现,叫噪美辛可以抑制肿瘤的生长,并能延长动物的存活时间。给乳腺癌骨转移的患者每天口服INloo一巧omg,两周后胸壁转移结节(0.5一1 .ocm)消失。Panje给7例头颈部恶性肿瘤患者每日口服IN(75一loomg),几周后肿瘤生长均受到不同程度的抑制,此外IN对肺癌、膀胧癌、食管癌、肠癌、肝癌等都有很积极的疗效。肿瘤流行病、临床研究以及动物实验均显示IN具有明显的抗肿瘤作用,但其确切机理尚不十分清楚,尤其是在肿瘤亲和性方面的研究,国内外尚未见报道。 本实验首次将氖标记的叫噪美辛引人到荷瘤鼠体内,观察了IN的生物学分布特征及其肿瘤趋向性。巧CT研究结果证明’H一IN在荷瘤鼠的肿瘤组织中有明显的放射性浓聚即IN有很好的瘤组织亲和性,且能够在肿瘤细胞中存留较长时间,这为IN发挥抗肿瘤作用提供了必要的条件。 应用ARG技术,观察到玩wis肿瘤细胞的细胞浆及细胞核均有较多的银颗粒分布,在用药后7一4h尤为显著,这可能是IN进人到肿瘤细胞后与胞浆中的某些大分子物质结合而存留于细胞内;此外,IN也可能破坏细胞膜,进人到肿瘤细胞内改变细胞内外的生理生化微环境及细胞周期,促进肿瘤细胞调亡,甚至可能直接杀伤肿瘤细胞。结论 本研究应用液闪测量及放射自显影技术,证实叫噪美辛有很好的肿瘤亲和性,主要分布于肿瘤细胞的胞浆和胞核内,可能有直接杀伤肿瘤细胞的作用。