白蜡虫蜡酯合酶基因dsRNA的合成及其在Sf9中的表达

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白蜡虫(Ericerus pela Chavannes)二龄雄虫分泌的白蜡,是重要的工业原料,广泛地应用于化工、食品、医药、化妆品等行业。蜡酯合酶(wax synthase,WS)在白蜡生物合成途径中催化长链脂肪醇和脂酰辅酶A生成酯,是蜡酯生物合成的关键酶。本研究根据实验室前期获得的ws全长序列,扩增其cDNA全长,用试剂盒体外转录了ws基因的dsRNA,注射于白蜡虫雌成虫体内,并用荧光定量PCR检测ws基因的干涉效果,为验证ws的生理功能奠定了基础;同时利用Bac-to-Bac表达系统构建了ws基因的pFastBacTMHT B表达载体,转化大肠杆菌DH10BacTM,经抗性和蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid/EpelWS,转染Sf9(Spodoptera frugiperda)细胞,在Sf9细胞中初步进行表达,免疫荧光观测并用蛋白免疫印迹验证WS的表达。主要研究结果如下:(1)成功用试剂盒体外转录了ws基因的dsRNA,检测结果表明,dsRNA已成功合成。(2)荧光定量PCR结果表明,注射ws基因的dsRNA一周后的试验组白蜡虫与经gfp基因的dsRNA处理的对照组相比,试验组体内ws mRNA转录量明显下调,为后续功能的研究奠定了基础。(3)利用Bac-to-Bac表达系统成功构建了WS表达载体,PCR鉴定及测序结果表明,目的片段已插入载体中。获得了重组杆粒rBacmid/EpelWS,转染Sf9细胞后收获了P3病毒,蛋白免疫印迹表明:被P3病毒感染后的Sf9细胞总蛋白中,存在目的蛋白产生的杂交反应,WS被成功表达。本研究体外转录了白蜡虫ws基因的dsRNA,并在昆虫细胞中成功表达了WS,为白蜡虫ws的生理功能及WS的生化特性的进一步研究奠定了重要基础。
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