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苹果(Malus domestica)是蔷薇科苹果属的一种多年生落叶乔木,在我国种植范围较广。近年来全球土地的盐渍化和次生盐渍化现象也越来越严重,盐胁迫严重影响着苹果的质量和产量。本实验室前期对耐盐的‘寒富’苹果同源四倍体及‘寒富’苹果进行数字表达谱和小RNA组测序分析发现miR156-SPL模式表达水平呈现显著差异。已有报道miR156-SPL模式参与调控植株形态建成、阶段转变、花和果实的发育等多个生理生化过程。本研究以苹果miR156a和MdSPL3基因作为研究对象,探究两者在盐胁迫作用下调控苹果耐盐性的机制。主要研究结果如下:1.‘寒富’苹果同源四倍体植株叶片宽厚、颜色深绿,其叶片的光合特性和叶绿素荧光参数明显优于二倍体;盐胁迫处理下,‘寒富’苹果同源四倍体的耐盐性要明显强于二倍体。miR156a和MdSPL3基因在‘寒富’苹果及其同源四倍体叶片中差异表达,且miR156a和MdSPL3基因的表达均受盐胁迫的影响。RLM-5’RACE结果表明MdSPL3基因转录本3’UTR区域有miR156a靶位点,且该切割位点在miR156a的5’端的第10和11位的C和U碱基之间。证明苹果miR156a靶向调控MdSPL3,推测该调控模式参与调控苹果对盐胁迫的响应机制。2.从‘寒富’苹果叶片中克隆了MdSPL3基因,发现其编码区序列长度为507 bp,编码168个氨基酸,氨基酸序列比对发现其与蔷薇科中白梨的同源性最高,且该蛋白序列具有典型的SBP保守结构域。亚细胞定位和转录活性分析试验表明,MdSPL3是具有转录激活活性的核蛋白。3.分别构建了miR156a和MdSPL3基因的植物过表达载体pRI-miR156a-An和pRI-MdSPL3-An,并通过农杆菌介导的遗传转化将其转化到苹果‘GL-3’叶片中,得到过表达miR156a的转基因株系2个和过表达MdSPL3的苹果转基因株系6个。对不同转基因植株进行盐胁迫处理,结果表明过表达miR156a的转基因植株(miR156a-OE)耐盐性最弱,其叶片内MDA含量最高,而过表达MdSPL3的转基因植株(MdSPL3-OE)的耐盐性优于非转基因对照(CK),其叶片内MDA含量最低;NBT和DAB染色结果表明盐胁迫下miR156a-OE植株叶片的超氧阴离子和过氧化氢含量最高,MdSPL3-OE植株叶片的超氧阴离子和过氧化氢含量明显处于较低水平;miR156a-OE植株叶片的SOD和POD酶活性最弱,而MdSPL3-OE叶片的SOD和POD酶活性要显著高于CK。此外,本研究还发现miR156a-OE株系侧根数量明显增多,而MdSPL3-OE株系侧根数量变少,但其平均根的长度得到了显著的提高。4.对MdSPL3-OE植株与对照植株进行转录组测序,发现了共有上调基因1163个(77%),下调基因349个(23%),之后筛选部分与胁迫相关的差异基因进行定量分析验证了转录组测序结果的正确性。筛选分离了5个响应盐胁迫且差异表达显著的基因,将它们的启动子序列与MdSPL3进行酵母单杂交试验,结果表明MdSPL3转录因子可以直接结合MdWRKY33基因的启动子。实验室前期获得了MdWRKY33-OE和MdWRKY33-RNAi植株,盐胁迫处理下,MdWRKY33-OE植株表现显著耐盐性而MdWRKY33-RNAi植株则相反。综上所述,我们推测miR156-MdSPL3模式通过直接调控MdWRKY33基因的表达响应植物盐胁迫。