研究背景与实验目的:原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）是一种器官特异性自身免疫性肝病,其特征是存在抗线粒体抗体,炎症和小叶间胆管破坏。95%以上的PBC患者的血清中存在抗M2型线粒体抗体（Anti-mitochondrial antibody,AMA）,其所针对的抗原主要是线粒体中的丙酮酸脱氢酶E2亚基（PDC-E2）。虽然PBC疾病的发病机制尚未完全清楚,易感基因和环境危险因素在PBC的发生发展中发挥着重要的作用。对自身组织（抗原）丧失免疫耐受是PBC疾病发生的基础。T淋巴细胞在这一过程中发挥着关键性的作用。T细胞受体（T cell receptor,TCR）是T细胞表面的一种特异性受体,负责识别由主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）所呈递的抗原和介导免疫应答,是T细胞识别不同的抗原及被激活的中心环节。而TCR的抗原特异性主要由β受体链的高变互补决定区 3（complementary determining regions 3,CDR3）决定。我们研究 PBC患者的初始和记忆T细胞,以及CD4+和CD8+T细胞的TCRβ CDR3免疫图谱,全面系统的分析PBC疾病的TCRβ CDR3免疫图谱特征,鉴定自身反应性TCR,为PBC的免疫治疗提供理论依据。PDC-E2在物种中高度保守,包括细菌和人。许多研究表明感染性因素是自身免疫耐受丧失的的触发因素。大肠杆菌PDC-E231-44/134-147/235-248抗原（E.coli PDC-E2）与人PDC-E2163-176抗原（human PDC-E2）的序列非常相似,并且这两个抗原表位在三维结构上也高度相似。鉴于这种高度相似性,宿主对细菌PDC-E2抗原的细胞免疫应答也会对自身的PDC-E2抗原起作用。因此,大肠杆菌PDC-E2与人PDC-E2之间的分子模拟可能是导致自身耐受丧失的关键因素。但目前为止,分子模拟机制在PBC疾病中的作用尚缺乏足够的理论依据。在本研究中,我们通过细胞培养和高通量测序技术试图从TCR免疫图谱的角度揭示PBC患者自身耐受丧失的机制。通过该研究我们希望对PBC的发病机制有更深的了解,也为基于TCR的免疫疗法在PBC中的开发应用提供理论依据。研究方法:通过收集,整理和详细分析8例PBC患者和8名健康成年人的临床资料,采用Ficoll-Hypaque离心法分离外周血（20mL）中的单个核细胞（PBMC）,利用流式细胞仪分选高纯度的CD4+初始T细胞,CD4+记忆性T细胞和CD8+记忆性T细胞,采用多重PCR技术扩增出TCRβ链的CDR3区,并应用高通量测序技术和生物信息学分析PBC患者和健康对照者不同T细胞亚群的TCRβ链的CDR3多样性、长度分布,共有程度,单核苷酸插入长度和频率以及TRBV基因亚家族的表达频率等图谱特征。此外,利用CD4+初始T细胞中的非功能TCRβ CDR3序列研究选择前（尚未经历阳性选择和阴性选择）的TCR免疫图谱。收集28例PBC患者和23名健康成年人的外周血样本和粪便样本。采用QiaAmp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取粪便DNA。定量PCR检测PBC患者和健康者肠道细菌中大肠杆菌的含量。使用免疫磁珠分选PBC患者外周血中的初始T细胞和记忆T细胞,通过体外细胞培养,加human PDC-E2和E.coli PDC-E2抗原刺激,扩增human PDC-E2和E.coli PDC-E2特异性的T细胞。通过免疫组库测序鉴定 human PDC-E2 和 PDC-E2 特异性 TCR。此外,比较 human PDC-E2 相关的TCRβ CDR3和E.coli PDC-E2相关的TCRβ CDR3的免疫图谱特征,包括长度分布、V-D插入长度、D-J插入长度以及TRBV基因亚家族的使用频率等图谱特征,从T细胞受体角度阐明PBC患者打破免疫耐受的分子机理。研究结果:第一部分:研究结果发现PBC患者组的CD4+/CD8+记忆性T细胞TCRβ CDR3免疫图谱多样性小于正常对照组,但差异不显著。但无论在PBC患者组还是正常对照组,CD4+记忆细胞的多样性远大于CD8+记忆细胞的多样性。PBC患者的高频TCRβ CDR3序列与健康者的高频TCRβ CDR3序列基本没有交集,两者间的免疫图谱具有显著性差异。与正常对照组相比,PBC患者的CD4+/CD8+记忆性T细胞TCRβ CDR3s长度更短,共有程度更高。PBC患者的V-D-J插入长度及插入的单核苷酸频率与正常组相比具有显著差异。此外,无论是在CD4+记忆细胞还是CD8+记忆细胞,PBC患者TRBV基因亚家族的表达水平与健康者相比具有显著差异,TRBV7-1（P=5.30 × 10-5）,TRBV21-1（P<1.00 × 10-6）和 TRBV23-1（P=2.43 ×10-2）在PBC患者的CD4+记忆细胞中低表达,而TRBV4-3（P<1.00 × 10-6）和TRBV7-2（P=1.22 × 10-2）在PBC患者的CD4+记忆细胞中高表达。PBC患者的CD8+记忆细胞中高表达 TRBV4-3（P<3.34×10-4）,低表达 TRBV6-4（P=8.24×10-3）,TRBV6-7（P=2.04×10-3）,TRBV21-1（P<1.00×10-6）,TRBV23-1（P=5.77×10-3）,TRBV6-7（P=2.48×10-2）。但TRBJ基因亚家族的表达水平与健康者相比没有显著差异。我们还鉴定了与PBC疾病相关的TCRβ CDR3序列,发现了一些保守的特征。第二部分:我们比较分析了 PBC患者和健康者的CD4+初始细胞的TCRβ CDR3免疫图谱,以非功能性TCRβ CDR3序列研究选择前的TCRβ CDR3免疫图谱,因为它们不受任何选择的影响（包括阳选和阴选）。以功能性TCRβ CDR3序列研究选择后的TCRβ CDR3免疫图谱。结果发现无论选择前还是选择后的免疫图谱,PBC患者CD4+初始细胞的TCRβ CDR3免疫图谱与正常对照组没有显著差异,两者间的克隆性扩增程度、TCR多样性、CDR3长度、共有程度以及TRBV和TRBJ基因亚家族的使用频率都相似。总的来说,PBC患者CD4+初始细胞的TCRβ CDR3免疫图谱是正常的,且选择前（尚未经历阳性选择和阴性选择）TCRβ CDR3图谱尚未异常。第三部分:定量PCR结果显示PBC患者肠道细菌中大肠杆菌的百分比高于健康者,提示大肠杆菌与PBC疾病具有某种关联。通过高通量测序我们鉴定了一系列 human PDC-E2 特异性 TCR 和E.coli PDC-E2 特异性 TCR。发现 human PDC-E2-特异性TCR序列与E.coli PDC-E2-特异性TCR序列有很多重叠,这说明识别human PDC-E2抗原的TCRβ CDR3序列也能识别E.coli PDC-E2抗原。此外,我们比较了PBC患者和健康者中human PDC-E2-特异性TCR和E.coli PDC-E2-特异性TCR序列的频率,发现无论是在记忆T细胞共培养体系还是初始T细胞共培养体系,PBC患者组的human PDC-E2-特异性TCR和E.coli PDC-E2-特异性TCR序列的频率显著高于健康对照组。我们还发现human PDC-E2-特异性TCR的频率明显高于E.coli PDC-E2-特异性TCR序列的频率。值得注意的是,我们还发现E.coli PDC-E2相关的TCRβ CDR3图谱与human PDC-E2相关的TCRβ CDR3图谱非常相似,在TRB V基因亚家族的使用频率,V-D插入长度,D-J插入长度和CDR3长度分布,单核苷酸插入频率以及氨基酸使用频率都具有相似性。因此,我们从T细胞受体角度揭示了人与大肠杆菌的PDC-E2的分子模拟机制,阐明了 PBC患者打破免疫耐受的分子机理。结论:PBC患者的CD4+/CD8+记忆性T细胞的TCRβ CDR3免疫图谱异常。但PBC患者的CD4+初始T细胞的TCRβ CDR3免疫图谱与健康者没有显著差异,且选择前（尚未经历阳性选择和阴性选择）的TCRβ CDR3图谱尚未异常。PBC患者记忆细胞的免疫图谱异常可能是其他原因造成的,比如其他易感基因或感染因素等的作用。PBC患者存在一些能既能识别human PDC-E2抗原也能识别E.coli PDC-E2抗原的TCRβ CDR3 序列,E.coli PDC-E2 相关的TCRβ CDR3 图谱与human PDC-E2相关的TCRβ CDR3图谱非常相似,揭示大肠杆菌是导致PBC患者自身耐受丧失的关键因素。