砂糖橘响应黄龙病菌及热处理胁迫的生理生化特征

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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing)是目前柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,对世界柑橘产业造成巨大的经济损失。根据几十年的研究和实践经验,柑橘黄龙病的防控主要采用以下综合策略:加强检疫、使用无病苗木、挖除病树和防治木虱等。但是至今没有针对黄龙病的特效药剂,也没有抗性栽培柑橘种质,科学家们长期以来一直在探寻防控黄龙病的有效方法。湿热处理就是其中一个研究较早且被尝试着用于生产中的方法。上世纪50年代,林孔湘先生最早提出用热处理消除柑橘芽条、苗木中的黄龙病菌。直至美国和巴西爆发了黄龙病之后,科学界又掀起了热处理研究的热潮。目前热处理黄龙病树的研究多基于症状和病原含量的变化,对其引起的寄主生理生化反应、基因水平和代谢水平的描述则较少。本研究室近年探索了用温控箱和田间热罩处理黄龙病树的方法,提出温控箱湿热处理能够有效消除带病苗木的黄龙病症状,并分析了黄龙病树热处理前后的柑橘转录组变化。在此基础上,我们对2年生的3株染病砂糖橘(Citrus reticulate Blanco CV.Shatangju)及3株健康砂糖橘进行热处理,得到以下结果:(1)热处理能消除2年生砂糖橘的黄龙病症状:严重感染黄龙病的砂糖橘树叶片表现出明显的斑驳、花叶、小叶和黄化症状,且树势衰弱;经4天湿热处理后,部分嫩枝条和嫩叶焦枯,老叶掉落;但经2个月恢复生长后,新长出的叶片青绿且富有光泽,整体树势接近未染病植株。经荧光PCR检测,新长出的叶片在一年内均没有黄龙病菌存在。(2)系统分析了热处理下的柑橘转录组学,发现热处理引起部分柑橘基因差异表达,用Real-time PCR和2-??Ct法测定了热处理前后部分基因的表达水平:热处理后染病柑橘植株中PPR基因表达高于未经处理柑橘植株;而苯丙素及类黄酮生物合成相关基因表达量低于未经处理柑橘植株。PPR上调意味着在高温和潮湿条件下,植株伤口愈合过程由植物自身调控进行。苯丙素及类黄酮合成途径中的相关酶由于热处理的影响会在短期内下调,一段时间后能恢复到原来的水平。(3)用试剂盒法测定热处理前后的带病及健康砂糖橘叶片中的淀粉和类黄酮的含量,发现热处理能减少因黄龙病引起的淀粉累积但是对类黄酮总物质含量影响不大:淀粉累积是黄龙病引起的重要生理特征,染病砂糖橘经热处理后新长出的叶片在第90天后淀粉含量显著低于未处理的染病砂糖橘,且与健康砂糖橘中的淀粉含量无显著差异。类黄酮的含量仅第365天所采样品中经热处理的染病砂糖橘中总类黄酮含量显著高于经处理的健康砂糖橘及未处理的染病和健康砂糖橘植株。(4)用非靶向液相色谱-质谱(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)代谢组学法高通量地解析柑橘响应热处理的物质变化,发现热处理显著诱导大量代谢物含量变化:(1)染病植株中奎宁酸、类黄酮、糖类及酮类化合物含量普遍高于健康植株,来自萜类化合物和聚酮化合物的生物碱的生物合成途径受到抑制;(2)热处理后,染病植株中糖类物质下调,氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、类黄酮、生物碱、糖苷及有机酸及其衍生物总体都为上调;(3)健康植株热处理后,萜类化合物、核苷酸及其衍生物和类黄酮物质含量表现为上调,类黄酮生物合成途径及色氨酸代谢被诱导。综上所述,本研究证明用温控箱湿热处理治理黄龙病苗木是可行的;初探了健康苗木和病树响应热处理的生理生化变化、基因表达和物质差异,为柑橘高温胁迫的分子机制研究提供理论基础;为将湿热处理用于果树细菌和病毒病害的治理提供重要参考。
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