目的:本研究探讨海珠益肝方对Con A(Concanavalin A,刀豆蛋白A)诱导的免疫性肝纤维化小鼠的疗效及可能的作用机制,探明肝纤维化与leptin(瘦素)、OB-Rb(瘦素受体)、JAK2(Janus Kinase 2,Janus激酶2)、STAT3(Signal transducer and activator 3,信号转导与转录激活因子3)之间的关系,明确JAK2/STAT3信号通路在肝纤维化发生、发展中的作用。本实验通过分析这一过程中所涉及的关键信号通路,探明海珠益肝方的抗肝纤维化的作用机制,为中医药防治肝纤维化提供新思路和策略。方法:将SPF级C57BL/6品系小鼠48只,随机分为4组,空白对照组、模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组,每组各12只?模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组均采用6mg·kg-1 w-1的剂量尾静脉注射Con A,每周1次,共12周,建立肝纤维化模型。模型复制成功后,分别给予相应药物灌胃干预治疗,其中秋水仙碱组给予0.25mg·kg-1d-1秋水仙碱,海珠益肝方组给予9.86g·kg-1d-1中药海珠益肝方,空白对照组和模型组均给予等剂量的蒸馏水。每日上午9:00和下午15:00各灌胃1次,连续4周。灌胃给药结束第2天早上处死小鼠,收集各组小鼠血液和肝脏、脾脏组织等相关标本。取肝脏组织作病理切片,采用HE染色法在光学显微镜下观察并评定小鼠肝组织病损积分;采用Masson染色法在光学显微镜下观察各组小鼠肝组织纤维化情况;采用电子显微镜观察各组小鼠肝组织超微病理结构变化。采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清ALT(alanine aminotransferase,丙氨酸氨基转移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天门冬氨酸氨基转移酶)、小鼠血清及肝组织匀浆上清液TC(total cholesterol,总胆固醇)、TG(triglyceride,甘油三脂)水平、肝组织匀浆MDA(malondialdehyde,丙二醛)及SOD(superoxide dismutase,超氧化物歧化酶)。采用双抗体夹心ELISA法检测各组小鼠肝组织匀浆上清液HA(hyaluronieacid,透明质酸)、LN(laminin,层粘连蛋白)、PC III(procollagenIII,III型前胶原)、CIV(collagen typeⅣ,Ⅳ型胶原)、各组小鼠血清LP(leptin,瘦素)水平。采用RT-PCR检测各组小鼠肝脏组织中leptin m RNA、OB-Rb m RNA、JAK2 m RNA、STAT3 m RNA转录水平。采用Western blot(免疫印迹试验)法检测各组小鼠肝组织中leptin、OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达水平。结果:1各组小鼠一般情况比较空白对照组小鼠一般情况好,行动灵活,正常饮食,被皮浓密有光泽,体重增长明显。模型组小鼠精神不振,喜卧少动,进食量较空白对照组有所减少,且皮毛松弛、杂乱蓬松无光泽、尿黄,体重增长缓慢。秋水仙碱组小鼠精神状态一般,活动较活跃,皮毛欠光滑,体重有所增加。海珠益肝方组小鼠精神状态良好,活动较活跃,进食量大于模型组及秋水仙碱组,皮毛顺滑有光泽,体重增加,仅次于空白对照组,一般情况均明显改善。2各组小鼠肝脏肉眼观察比较空白对照组小鼠肝脏质地柔软,表面光滑未见任何斑点、突起、结节,颜色略呈深红色且有光泽,边缘锐利。模型组小鼠肝脏质地较韧,表面见白点,部分肝组织表面粗糙,凹凸不平,颜色变暗红,边缘较钝。秋水仙碱及海珠益肝方组小鼠肝脏质地欠柔软,表面尚光滑,边缘较锐利,基本未见斑点、突起、结节等,颜色接近正常。3各组小鼠肝、脾指数的比较在肝指数方面同空白对照组相比较,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组各组小鼠肝指数均明显升高(P均<0.05)。模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组脾脏指数亦较空白对照组升高,差异有统计学意义(P均<0.05);与模型组比较,秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝、脾指数均有所降低,其差异均具有统计学意义(P<0.05);与秋水仙碱组在降低小鼠肝及脾指数方面进行比较,海珠益肝方组相关指标降低更多(P<0.05)?4海珠益肝方对肝纤维化小鼠肝组织病理的影响光镜下空白对照组肝组织清晰,肝细胞排列以中央静脉为中心,肝细胞浆均匀红染,细胞核大小正常,核质淡染,未见变性坏死,纤维组织增生及炎性细胞浸润。模型组小鼠肝组织结构紊乱,破坏明显,肝细胞索排列不整齐,肝细胞脂肪变性,部分坏死,中性粒细胞及淋巴细胞浸润,纤维组织大量增生,部分假小叶形成,肝细胞内脂滴较多。秋水仙碱组与海珠益肝方组肝脏损伤程度较模型组有所减轻。秋水仙碱组肝小叶结构破坏有所减轻,肝细胞排列较整齐,胶原纤维及炎细胞浸润均减少,肝细胞内脂肪较空白对照组明显增加。海珠益肝方组肝小叶结构破坏有明显改善,肝细胞排列较整齐,胶原纤维及炎细胞浸润均减少,肝细胞内脂滴少见。5海珠益肝方对肝纤维化小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA、SOD的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平均升高(P均<0.05),而肝组织匀浆SOD水平均下降(P<0.05);同模型组相比,秋水仙碱组小鼠血清ALT、AST水平均降低(P<0.05),而肝组织匀浆MDA、SOD未见明显变化;同模型组比较,海珠益肝方组血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平均降低(P均<0.05),而肝组织匀浆SOD水平均升高(P<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方在降低小鼠血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA水平方面优于秋水仙碱(P<0.05),在升高肝组织匀浆SOD水平方面优于秋水仙碱(P均<0.05)。6海珠益肝方对肝纤维化小鼠血清及肝组织匀浆TG、TC的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠血清TG、TC水平均降低(P均<0.05);同模型组比较,秋水仙碱组血清TG、TC水平未见统计学差异(P均>0.05);同模型组相比,海珠益肝方组血清TG、TC水平均升高,差异有统计学意义(P均<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组在升高小鼠血清TG、TC水平方面优于秋水仙碱(P<0.05)。同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆TG、TC均升高(P均<0.05);同模型组相比,秋水仙碱组肝组织匀浆TG、TC水平无统计学差异(P均>0.05);同模型组相比,海珠益肝方组肝组织匀浆TG水平降低(P均<0.05);同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组在降低小鼠肝组织匀浆TG、TC水平方面优于秋水仙碱(P<0.05)。7海珠益肝方对肝纤维化小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,秋水仙碱组、海珠益肝方组小鼠肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降(P<0.05)。海珠益肝方组肝组织匀浆HA、LN、PCⅢ、CIV水平显著性降低,优于秋水仙碱组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。8海珠益肝方对小鼠血清leptin水平的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组、海珠益肝方组血清leptin水平均明显升高(P<0.05);同模型对照组相比,秋水仙碱组和海珠益肝方组血清leptin水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。海珠益肝方组血leptin素水平显著性降低,优于秋水仙碱组(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。9海珠益肝方对小鼠肝组织leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达的影响同空白对照组相比较,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达显著增强(P<0.05)。与模型组相比,秋水仙碱组和海珠益肝方组leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达显著减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。海珠益肝方组在leptin、OB-Rb m RNA及蛋白表达方面比秋水仙碱组明显降低(P<0.05)。10海珠益肝方对小鼠肝组织JAK2、STAT3 m RNA及蛋白表达的影响同空白对照组相比,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组小鼠肝组织中JAK2 m RNA及蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05)。同模型组相比,秋水仙碱组及海珠益肝方组JAK2 m RNA及蛋白表达量显著性降低(P<0.05)。同秋水仙碱组相比,海珠益肝方组JAK2 m RNA及蛋白表达量有明显降低(P<0.05)。同空白对照组比较,模型组、秋水仙碱组和海珠益肝方组小鼠肝组织中STAT3 m RNA及蛋白表达量均高于空白对照组(P<0.05)。与模型组相比,秋水仙碱组及海珠益肝方组STAT3 m RNA及蛋白表达量有显著性降低(P<0.05)。与秋水仙碱组相比,海珠益肝方组STAT3 m RNA及蛋白表达量有明显降低(P<0.05)。结论:海珠益肝方可改善肝纤维化模型小鼠的一般情况:如改善模型小鼠的活动及体质量,改善食欲和饮水等症状,显著降低肝纤维化模型小鼠肝、脾指数。海珠益肝方有助于肝小叶结构恢复正常,减少纤维组织增生、肝细胞坏死变性以及炎性细胞的浸润等。能降低纤维化模型小鼠血清ALT、AST、肝组织匀浆MDA含量,升高肝组织匀浆SOD水平,降低肝组织匀浆中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量,具有抗肝细胞损伤,有效减轻炎症反应,促进ECM的降解,抑制纤维组织增生,改善肝纤维化小鼠的病理组织结构,达到抗肝纤维化的作用。同时海珠益肝方能调节血脂(TG、TC)水平,减少肝细胞内脂肪的堆积,保护肝细胞,从而抑制早期肝纤维化的启动。综上所述,海珠益肝方抗肝纤维化的作用机制可能为:1海珠益肝方明显降低纤维化模型小鼠血清leptin水平,有效的阻止因leptin与OB-Rb结合而发挥的诱导HSC活化和增殖作用。2海珠益肝方明显抑制纤维化模型小鼠肝组织leptin及其受体表达,提示Leptin是海珠益肝方抗肝纤维化的作用靶点之一。3海珠益肝方能够降低肝纤维化小鼠肝组织JAK2、STAT3的表达水平,从而影响HSC活化、增殖,减少胶原纤维的表达及分泌,达到抗肝纤维化的作用。海珠益肝方具有抑制OB-Rb及其信号转导的作用,这可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。瘦素调控的JAK2/STAT3信号转导通路可能是海珠益肝方抗肝纤维化的作用途径和作用靶点。