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草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)ORF VI编码的P6蛋白已证明是一个RNA沉默抑制子,能够抑制ss GFP诱导的16c本氏烟(Nicotiana benthamiana16c line)局部沉默,但其抑制沉默的机制尚不明确。本课题研究P6抑制沉默的机制,明确P6不能抑制ds GFP诱导的基因沉默,亦不能局部回复已沉默16c本氏烟的GFP基因。本研究还克隆了SVBV沈阳分离物(SVBV-SY)和SVBV北京分离物(SVBV-BJ)的全长基因组;构建了SVBV-SY和SVBV美国分离物(SVBV-US)的侵染性克隆,明确了2分离物侵染森林草莓(Fragaria vesca)引起的表型差异;构建了P6基因移码突变的SVBV-US侵染性克隆,证明P6是SVBV侵染森林草莓的必要基因;并构建了SVBV病毒载体,能够侵染森林草莓,为研究SVBV病毒基因和草莓基因的功能提供了研究工具。1.SVBV P6不能抑制ds GFP介导的RNA沉默含重组质粒p CAM-P6、p CAM-GFP和p CAM-ds GFP的农杆菌混匀共浸润本氏烟,3天后在UV光下观察发现,叶片浸润部位无明显的绿色荧光,表明P6不能抑制ds GFP介导的RNA沉默。2.SVBV P6不能局部回复已沉默的16c本氏烟含重组质粒p CAM-GFP的农杆菌浸润16c本氏烟,30天后观察发现,植株绿色荧光消失,呈均匀的红色,GFP基因完全沉默。含重组质粒p CAM-P6的农杆菌单独浸润上述已沉默的16c本氏烟,3 d后在UV光下观察发现,叶片浸润部位无明显绿色荧光。含重组质粒p CAM-P6的农杆菌与含重组质粒p CAM-GFP的农杆菌共浸润已沉默的16c本氏烟,3 d后在UV光下观察发现,叶片浸润部位亦不出现明显的绿色荧光。说明SVBV P6蛋白不能局部回复已沉默的16c本氏烟。3.SVBV沈阳分离物和SVBV北京分离物全长基因组的克隆采集感染SVBV的草莓样本,提取总DNA。以此为模板,PCR分段扩增出SVBV-SY和SVBV-BJ片段,拼接获得全长基因组克隆p SVBV-SY和p SVBV-BJ。SVBV-SY基因组序列全长7864 bp,序列登录号为KP311681。SVBV-BJ基因组序列全长7863 bp,序列登录号为KR080547。比对基因组全序列发现,SVBV-SY与SVBV-BJ全长基因组序列相似性很高,达到97.8%,2分离物与已报道的SVBV其他分离物全长基因组序列相似性较高,达85.7%~94.2%,而与花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)其他成员全长基因组序列相似性较低,仅为43.5%~45.9%。进一步比对分析SVBV-SY和SVBV-BJ各ORFs核苷酸序列与已报道的SVBV其他分离物各ORFs核苷酸序列,发现ORF II序列变异最大,相似性为74.3%~75.1%,而ORF V序列变异最小,相似性高达88.8%~97.6%。4.SVBV-SY和SVBV-US侵染性克隆的构建及其侵染性鉴定利用SVBV全长基因组克隆p SVBV-E3构建SVBV-US侵染性克隆p BIN-1.25SVBV-US,转化农杆菌GV3101,接种森林草莓(F.vesca)、栽培草莓(F.×ananassa)、普通烟(Nicotiana tabacum)、本氏烟(N.benthamiana)、三生烟(N.tabacum var.Samsun NN)和心叶烟(N.glutinosa)验证侵染性。8周后观察发现,接种SVBV-US侵染性克隆的森林草莓表现明显的叶脉镶边黄化症状。而接种SVBV-US侵染性克隆的栽培草莓和4种烟草属植物均未表现明显症状。PCR检测表明,SVBV-US侵染性克隆能高效侵染森林草莓和栽培草莓,而不能侵染4种烟草属植物。利用SVBV全长基因组克隆p SVBV-SY构建SVBV-SY侵染性克隆p BIN-1.25SVBV-SY,转化农杆菌GV3101,接种森林草莓和栽培草莓验证侵染性。8周后观察发现,接种SVBV-SY侵染性克隆的森林草莓表现叶片扭曲、提前开花、植株衰弱症状。而接种SVBV-SY侵染性克隆的栽培草莓不表现明显症状。PCR检测表明,SVBV-SY侵染性克隆能够高效侵染森林草莓,但不能侵染栽培草莓。5.SVBV-US P6移码突变侵染性克隆的构建及其侵染性验证移码突变SVBV-US P6,获得含有突变的SVBV全基因组克隆p SVBV(ΔP6)。进一步构建得到P6移码突变的侵染性克隆p BIN-1.25SVBV(ΔP6),转化农杆菌GV3101,接种森林草莓验证侵染性。8周后观察发现,森林草莓不表现明显症状,PCR未检出SVBV cp基因。说明P6移码突变侵染性克隆不能侵染森林草莓。6.SVBV病毒载体的构建将多克隆位点插入缺失ORF II的p SVBV-E3,获得重组载体p SVBV-MCS。再进一步构建SVBV病毒载体p BIN-1.2SVBV-MCS,转化农杆菌GV3101,接种森林草莓验证侵染性。8周后观察发现,森林草莓不表现明显症状,但PCR能够检测到SVBV cp基因。将森林草莓Fv Su基因部分片段插入SVBV病毒载体,接种森林草莓,发现森林草莓亦不表现叶脉黄化镶边症状,但PCR能够从新生叶片中检测到SVBV cp基因和插入的Fv Su基因。说明构建的SVBV病毒载体能够侵染森林草莓。