半夏始载于《神农本草经》,为天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥块茎。主产于四川、甘肃、贵州、湖北、山西、河北等地,具有燥湿化痰,降逆止呕,消痞散结等功效。在临床配伍和中成药配方中应用十分广泛,如保和丸、保宁半夏颗粒、半夏止咳糖浆、藿香正气液等。本文主要针对半夏药材质量评价不全面、市售半夏伪品现象严重、半夏药材分级缺乏科学评价指标、种茎标准缺失、不同叶型半夏遗传物质及品质差异不清楚等突出问题,以药材质量评价为核心,开展半夏质量标准提升、药材等级标准、种茎分级标准、不同叶型遗传物质与品质相关性研究,为全面提升半夏药材质量提供科学依据。研究结果如下:1半夏药材质量标准提升研究本文对半夏药材性状、外源性有害物质检查、含量测定、指纹图谱、半夏伪品补充检验方法等进行了研究,结果表明:(1)直径范围为“0.5~1.0 cm”的半夏药材属于半夏药材重要的组成部分,不同直径范围的半夏药材的浸出物、有机酸含量、核苷含量无显著性差异,建议将半夏药材直径范围由“1.0~1.5 cm”修订为“0.5~1.5 cm”。(2)对半夏重金属及有害元素、农药残留、黄曲霉毒素等外源性有害物质进行检测,36批样品中仅有3批半夏药材中镉少量超标(较限量标准0.3 mg/kg高0.015~0.039 mg/kg),表明半夏在外源性有害物质方面安全性较高。(3)采用HPLC、HPLC-MS、NMR等方法对半夏化学成分进行分析研究,从半夏中分离、鉴定了反式乌头酸、顺式乌头酸、富马酸等3个新成分,建立了枸橼酸等7个有机酸类成分、腺苷等9个核苷类成分等多成分多指标的含量测定方法,并建议将枸橼酸、L-苹果酸、草酸的含量测定纳入《中国药典》2020年版。(4)在半夏有机酸含量测定基础上,建立了半夏中有机酸类成分的指纹图谱,指认了7个色谱峰,可用于半夏药材质量控制。(5)首次从虎掌南星中分离鉴定了特征成分水麦冬酸,建立了基于特征成分水麦冬酸检测的“半夏补充检验方法”,该方法专属性强,准确度高,可用于检测半夏药材与饮片中虎掌南星的掺伪情况,通过对123批半夏及饮片进行检测,伪品检出率47.1%,其中生半夏伪品率69.2%,姜半夏伪品率30.8%,清半夏伪品率31.8%,法半夏伪品率44.4%。2半夏药材商品等级标准研究本文通过对不同直径范围半夏药材的直径、浸出物、7个有机酸含量、9个核苷含量、指纹图谱进行分析,结果显示:(1)不同直径范围的半夏样品其浸出物、有机酸、核苷含量的总体趋势为直径越大含量越高,但无显著性差异,比较来源为同一批的半夏样品,其含量高低无规律性;(2)指纹图谱以1.2 cm<直径≤1.5 cm的半夏为对照,0.8 cm<直径≤1.0 cm及1.0cm<直径≤1.2 cm半夏相似度高,而直径为0.5 cm<直径≤0.8 cm及1.5 cm<直径≤2.0 cm半夏相似度低于0.9,存在一定差异;(3)0.5 cm<直径≤0.8 cm的半夏每千克粒数范围为3395~6020,平均为5108±675,直径大于1.5cm的半夏其性状变异严重,多具子块茎,常与伪品虎掌南星混淆,且在半夏样品中占比及批次较少,不具有代表性,建议不纳入药材分级。因此,按照三级分级原则,主要以药材直径和每千克粒数制定半夏药材等级标准(草案),其中一等半夏:1.2 cm<直径≤1.5 cm,每千克1000粒以内;二等半夏:1.0 cm<直径≤1.2 cm,每千克1800粒以内;三等半夏:0.8 cm<直径≤1.0 cm,每千克3200粒以内。3半夏种茎分级标准研究通过半夏种茎质量指标、田间试验、药材产量及质量分析,建立半夏种茎分级标准(草案),其中一级种茎:0.5 cm<直径≤1.0 cm,纯度≥97%,净度≥90%,水分≥50%,发芽率≥95%;二级种茎:1.0 cm<直径≤1.5 cm,纯度≥97%,净度≥90%,水分≥50%,发芽率≥90%。4不同叶型半夏遗传物质与品质的相关性研究(1)不同叶型半夏化学成分分析对前期筛选的性状稳定的芍药叶型、桃叶型、竹叶型、柳叶型等4种叶型半夏为材料,不同叶型半夏总生物碱、总有机酸含量存在明显差异,总生物碱及总有机酸含量均以竹叶型最高,其次为芍药叶型和桃叶型,柳叶型半夏含量最低。不同叶型半夏中枸橼酸等7种有机酸含量也存在一定差异,均主要含枸橼酸,其中桃叶型半夏枸橼酸含量显著高于其它叶型半夏,草酸、反式乌头酸含量也较高;芍药叶型半夏草酸、顺式乌头酸含量较高;竹叶型半夏富马酸、顺式乌头酸、反式乌头酸含量较高;不同叶型半夏L-苹果酸、琥珀酸含量无明显差异。(2)半夏转录组测序采用Illumina HISeq 2000测序平台对前期筛选的性状稳定的芍药叶型、桃叶型、竹叶型、柳叶型等4种叶型半夏进行转录测序分析,测序共得到53.22Gb Clean Data,通过组装共获得了126391条转录本,总长度105613896bp,平均读长835bp。通过KEGG数据库比对,有8条代谢通路共计723个基因参与生物碱代谢,31条代谢通路共计8709个基因参与有机酸代谢。(3)不同叶型半夏主要活性成分代谢相关功能基因表达差异分析及基因挖掘不同叶型半夏基因表达差异显著,以桃叶叶形半夏为对照,芍药叶型、竹叶型、柳叶型半夏差异表达基因分别注释到110、106、94条代谢通路,差异表达基因数分别为1206、707、262个,其中富集到代谢途径的差异表达基因数分别为509、415、163个;与生物碱的代谢途径中,筛选得到了4个参与麻黄碱代谢的Unigene;在枸橼酸等有机酸的代谢途径中,筛选得到了11条参与枸橼酸等主要有机酸代谢的Unigene,通过qPCR验证,筛选的15条候选基因的相对表达量与转录组结果规律基本一致,表明转录测序结果准确、可靠;不同叶型半夏中有机酸含量以桃叶型半夏的枸橼酸含量最高,与pckA、MDH1、ACO、CS、ACLY等酶基因的差异表达密切有关,相关功能基因的发现为半夏有机酸高含型新材料的挖掘、分子辅助育种的开展提供了数据支撑。综上,本文从半夏药材质量标准提升研究、药材商品等级标准研究、半夏种茎分级标准研究、不同叶型半夏遗传物质与品质的相关性研究等方面进行了针对性的研究,为全面提高半夏药材质量、挖掘半夏优质资源、实现半夏药材优质优价奠定了基础。