毛囊干细胞(Hair follicle stem cells)位于毛囊隆突部(Hair Bulge),属于成体干细胞,具有多向分化潜能,是毛囊(Hair follicle)中的原始细胞,能通过自身的分裂增殖产生多种机体所需的细胞,与毛发周期的维持、皮肤组织的更新和损伤修复等密切相关。毛囊干细胞与毛囊周期状态密切相关,毛囊周期根据毛囊干细胞活跃程度和毛囊形态划分为三个阶段:生长期、退化期和休止期。目前分离毛囊干细胞的方法主要分为机械分离法和酶消化法,本研究比较了国内外已经发表的有关毛囊干细胞分离纯化的方法,通过对比实验找到了两种体外分离培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法,分别命名为“毛囊法”和“组织块法”,通过比较两种方法体外分离培养的毛囊干细胞细胞形态、细胞活力、复苏存活率、克隆形成率以及毛囊干细胞标记物表达水平,找到了效果最好的方法。本研究还构建了 CMTM3的过表达和干扰腺病毒载体,探究其在长江三角洲白山羊毛囊干细胞增殖过程中的生物学功能;同时我们还研究了生理浓度的雄激素(优质笔料毛个体血液中雄激素浓度)对于毛囊干细胞增殖的影响。本研究表明:(1)采用毛囊法分离培养的原代毛囊干细胞生长速度较快,增殖分裂状态良好,呈现典型的铺路石状,毛囊干细胞标记物阳性率达到90%以上。组织块法分离培养的毛囊干细胞在细胞活力、毛囊干细胞标记物阳性率等方面逊色于毛囊法,但是该方法操作简单、方便。(2)提高CMTM3基因在毛囊干细胞中的表达水平后,DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HSPA1mRNA的表达水平显著上升(P<0.05);转染干扰腺病毒载体并添加生理浓度的雄激素后DUSP6、DUSP1、MAP3K1、HASP mRNA的表达水平显著上升(P<0.05),FLNA、FOS mRNA的表达水平显著下降(P<0.05)。(3)Western Blot检测结果表明,在转染过表达腺病毒载体后MAP3K1、DUSP1、FOS、HSPA1蛋白的表达水平显著增强(P<0.01),培养基中添加生理浓度的雄激素后MAP3K1、DUSP1蛋白表达水平显著增强(P<0.01);在转染干扰载体后MAP3K1、DUSP6、HSPA1蛋白的表达水平显著增强(P<0.01)。(4)提高毛囊干细胞中CMTM3基因的水平可以使细胞活力下降,同时G1期的细胞比例显著上升(P<0.05),毛囊干细胞的凋亡率显著上升(P<0.05);转染干扰腺病毒载体后细胞活力增强,S和G2期的细胞比例显著上升;在培养基中单独添加生理浓度的雄激素能使细胞活力增加,S和G2期的细胞比例显著上升。表明抑制毛囊干细胞中CMTM3基因的表达和添加生理浓度的雄性激素都可以都促进毛囊干细胞的增殖,二者的作用相互协同。(5)雄性激素受体(AR)、表皮细胞生长因子(EGF)在优质笔料毛组的水平最高(P<0.05),在去势公羊组中最低,VEGFA、IGF-1在去势公羊组中表达水平最高。推测高水平的EGF有利于长江三角洲白山羊优质笔料毛的产生,高水平的VEGFA、IGF-1可能会促使非优质笔料毛个体和去势公羊产生普通的粗毛。综上所述,本研究建立了两种分离长江三角洲白山羊毛囊干细胞的方法,通过“毛囊法”体外分离培养的毛囊干细胞细胞活力更高并且毛囊干细胞标记物表达量最高。在毛囊干细胞中过表达或干扰CMTM3基因的表达水平可以影响毛囊干细胞中相关基因的表达水平,提高毛囊干细胞中CMTM3基因的表达水平可以抑制毛囊干细胞的增殖,促进细胞凋亡;抑制毛囊干细胞中CMTM3基因的表达水平可以促进毛囊干细胞的增殖,增加G2、S期细胞的比例,抑制细胞凋亡;在培养基中单独添加生理浓度的雄激素也能促进毛囊干细胞的增殖;抑制毛囊干细胞中CMTM3基因的表达水平并添加生理浓度的雄激素对毛囊干细胞的促生长作用最为显著。