难愈性创面（Refractory Wound，RW）是指在期望的时间内不能正常愈合，与创面所在部位和宿主本身疾病有关的一类创面，目前临床上发病率非常高。细胞移植疗法(Cell Transplantation Therapy，CTT)不依赖于外科植皮手术，能够显著改善创面愈合质量。目前细胞移植疗法相关的基础与临床研究是国内外研究热点，且治疗所应用的种子细胞来源广泛，具有良好的应用前景。近年来随着材料科学的发展，选择一种与细胞移植疗法相适应的生物工程材料可以为难治性创面治疗提供不同的治疗策略。壳聚糖(Chitosan，CS)作为一种生物相容性极佳的可降解材料，对人体无毒副作用，且具有抗炎、抗氧化、止血、促进创面愈合、镇痛、抗感染等多种利于机体修复的生物学特性，是一种非常适合应用于难愈性创面修复的生物工程材料。壳聚糖水凝胶(Chitosan Hydrogels，CSH)目前已广泛应用于生物医药等领域，临床实验已取得一定成果，但其相关机制研究仍不甚明确，制约了其在皮肤创面愈合方面进一步的临床应用。本文旨在通过实验合成一种新型壳聚糖水凝胶，联合脂肪间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal StemCells，ADSCs）共同应用于难愈性创面的治疗，研究壳聚糖水凝胶联合ADSCs对难愈性创面的疗效并探讨其部分生物学机制，为临床治疗难愈性创面提供一种新的治疗策略。目的：通过建立一种高效的ADSCs分离培养体系，观察ADSCs的生物学特征并通过适宜培养方法实现ADSCs的大规模扩增，并对新型壳聚糖水凝胶的制备方法进行探索性研究，并系统性分析其成膜性、细胞毒性及表面结构，观察壳聚糖水凝胶联合ADSCs对难愈性创面愈合的促进作用，并对其生物学机制进行深入探讨。方法：选用SPF级绿色荧光蛋白（Green Flourescent Protein，GPF）转基因小鼠，取腹股沟处脂肪垫，胶原酶消化法获取ADSCs，流式分析细胞表面特异性标志物，并诱导细胞向成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞方向分化，观察ADSCs多向分化能力。制备成功的壳聚糖膜后用扫描电镜检测其表面结构，同时制备壳聚糖膜的浸液，进行ADSCs细胞毒性检测。将制备成功的小鼠全层皮肤缺损模型为四组：A组：生理盐水组；B组：CSH组；C组：ADSCs组；D组：CSH+ADSCs组。术后每天观察创面有无感染、异常分泌物等情况，并隔天记录创面面积以计算创面愈合率。术后14d在取创面皮肤组织进行冰冻切片，观察创面皮肤组织中GFP阳性细胞存活情况，以评估ADSCs参与创面愈合情况，HE切片观察创面皮肤组织中肉芽组织增生和上皮化过程。同时行Western Blot方法检测创面组织GFP、VEGP蛋白表达情况。结果：1.实现了ADSCs的成功分离，其形态上呈纺锤形，具备典型的间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）的形态学特征。流式检测结果显示ADSCs高表达间充质标记物CD10、CD13、CD166以及粘附因子CD29及CD54；低表达造血系细胞表面标记物CD34及血管内皮性抗原CD45。ADSCs成脂细胞诱导后，苏丹Ⅲ染色示细胞中心发现橘黄色小泡；ADSCs成骨细胞诱导后ALP碱性磷酸酶染色示细胞有黑色结节；ADSCs成软骨细胞诱导后阿辛蓝染色后细胞呈紫色。2.制备成功的CSH通体透亮，微呈黄色或无色，呈半流动凝胶状。制成后的CSD体积萎缩明显，并具有一定柔韧性和吸水性。5万倍扫描电镜结果显示壳聚糖膜膜体表面呈颗粒状，有大小不一裂隙。细胞毒性实验表明，壳聚糖膜具有良好的生物相容性。3.皮肤全层损伤模型显示：与对照组相比，术后14d和18d时D组创面愈合率较高（P<0.05），在术后21d时B组、C组和D组的创面愈合率都要高于A组（P<0.05）。HE染色显示，实验组B组、C组和D组各组与正常皮肤结构形态相似，且D组形态最为接近正常皮肤结构。荧光显微镜下，移植了ADSCs的C组和D组创面组织可见位于散落点状荧光，且D组荧光强度高于C组。光镜观察：HE染色发现B组、C组、D组的创面修复速度和炎性细胞浸润状况低于对照组A组。创面蛋白表达：Westemblot结果表明，D组术后第14天VEGF蛋白表达水平明显高于对照组A组，而且以D组表达最高(P<0.05)。结论：1.本实验分离所得细胞高表达CD10、CD13、CD29、CD54、CD166，低表达CD34及CD45，表面标记物符合文献已报道的ADSCs表型。ADSCs可诱导分化成脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞，具有多向分化潜能。2.壳聚糖有很好的吸附性、成膜性、吸湿性和保湿性，且生物来源广泛、价格低廉、安全无毒，是一种极佳的可应用于创面修复的生物工程材料。本研究制成的壳聚糖水凝胶具有安全低毒，易成膜的特性，可作为创面的生物敷料应用于临床。3. ADSCs免疫原性低，移植于小鼠创面后一定时期内仍可在组织内存活而不被宿主排斥，保证了移植后早期细胞持续发挥作用，壳聚糖可在创面上形成一层保护膜，起到了保护创面且防止移植的ADSCs流失的作用。CSH联合ADSCs作用于创面后能加速创面愈合，提高创面愈合质量，是一种非常有效的治疗难愈性创面的方法。