细胞不可逆地脱离细胞周期,丧失增殖能力,达到一种相对稳定的状态,这种状态被称为细胞衰老（cellular senescence）,它能够改变微环境和组织稳态。许多研究证明,肿瘤的发生、发展以及治疗都与细胞衰老有着密切的联系。一方面,表现出无限增殖能力的肿瘤细胞通常具有衰老障碍的特点,最终表现为细胞周期调控机制的紊乱。肿瘤发生的前提条件是细胞突破周期调控机制获得无限分裂增殖能力,即永生化,肿瘤细胞无限分裂增殖的必要条件则是细胞衰老相关调控信号通路的障碍,而这种细胞衰老相关调控信号通路的障碍则是肿瘤发生的早期事件之一。另一方面,我们知道细胞凋亡和细胞自杀是细胞抑制肿瘤形成的重要途径,除此之外,细胞还可以通过进入衰老的状态来阻滞细胞周期,影响细胞分裂,进而抑制肿瘤的发生。随着衰老研究的不断进行,细胞衰老是阻止肿瘤形成的天然屏障这一观点得到了越来越多研究者的认可。因此,探讨细胞衰老与肿瘤发生之间的关系,将细胞衰老与肿瘤形成机制及肿瘤治疗联系在一起,将为肿瘤发生机制和治疗方案的研究带来很多有益的启示。肝癌是一种严重危害我国人民身体健康的恶性癌症之一,近年来我国肝癌的发病率逐年上升,据统计全世界肝癌发病总人数的二分之一以上分布在中国,我国已经成为一个名副其实的“肝癌大国”^[1]。肝细胞癌在肝癌患者中的比例高达80%以上,通常发生在慢性肝损伤患者中。慢性肝损伤是一种由多种损伤因素如病毒感染、长期饮酒、药物毒性、遗传性物质代谢障碍所引起的进行性肝实质细胞破坏与再生的复杂病理过程,而这些病理变化往往通过不同的机制促进了肝病的进展,并成为肝癌发生发展的诱因。研究慢性肝损伤中细胞衰老与肝癌发生发展的关系,对阐明肝癌的发生机制与发展肝癌的治疗方案具有重要意义。本课题的研究内容主要分为四个部分。首先,我们建立了急性和慢性肝损伤的动物模型,并开展了急慢性损伤下肝脏的病理变化规律和肝细胞衰老规律的研究。延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,Fah）基因敲除小鼠,简称Fah^-/-小鼠,是由Grompe等建立的酪氨酸血症I型小鼠模型。该模型由于FAH的缺失使得酪氨酸代谢受阻,产生具有DNA损伤作用的毒性代谢产物从而导致急性肝损伤,小鼠因肝衰竭8周左右死亡。添加药物NTBC能够抑制酪氨酸代谢上游代谢酶活性,从而抑制毒性代谢产物产生,Fah^-/-小鼠表现为正常表型。当仅添加2.5%治疗剂量的NTBC饲养时,Fah^-/-小鼠发生慢性肝损伤。我们分别对8周龄的Fah^-/-小鼠给予停药处理和给予2.5%治疗浓度的NTBC处理,使得两组小鼠分别出现肝脏急性损伤和慢性损伤。我们发现给予2.5%治疗剂量NTBC的Fah^-/-小鼠直到8周仅表现为较轻的慢性肝脏病变,如小的炎症坏死灶、小的脂肪变性病灶及轻微的核多态化和肝细胞肿胀,而完全停药组在8周时呈现出严重的急性肝损伤,主要表现为大量肝细胞多核化、广泛的弥漫性坏死、胆管增生性病变及严重的肝细胞脂肪变性和肿胀。由于细胞周期阻滞细胞不能完成正常分裂可导致衰老细胞的体积增大,因此细胞体积的变化可以用来指示细胞衰老。利用肝细胞面积作为分析肝细胞体积变化的指标,我们发现急性损伤4周和8周时,Fah^-/-小鼠的肝细胞面积显著增大,而慢性损伤时Fah^-/-小鼠其肝细胞面积在4周时没有明显增加,在8周时虽有所增加但仍显著低于急性损伤组。这提示我们不同肝损伤程度下肝细胞衰老的状况不同。为了进一步确认急慢性肝损伤下肝细胞衰老的情况,我们建立了综合的肝细胞衰老鉴定方案,包括衰老相关半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、衰老相关的异染色质（SAHF）染色和细胞周期抑制因子p53及p21的表达水平检测。为了明确急性肝损伤下Fah^-/-小鼠肝细胞的衰老规律,我们在Fah^-/-小鼠急性损伤后0、2、4、6、8周等五个时间点分别取材,利用建立的衰老评价方案进行评价,我们发现随着急性肝损伤时间的增长,肝细胞衰老相关的各项指标表达不断升高,从而表明急性损伤下Fah^-/-小鼠肝细胞确实发生了衰老,Fah^-/-小鼠肝细胞表现出稳定的衰老表型。为了进一步验证我们的推断:慢性损伤下Fah^-/-小鼠肝细胞未发生细胞衰老。我们在慢性损伤后0、4、8、12周等四个时间点分别取材,我们发现慢性损伤下Fah^-/-小鼠肝细胞并未表现出稳定的衰老表型。结合急慢性肝损伤下不同的个体命运,我们提出这样的假设:肝细胞衰老的诱导需要损伤程度达到一定阈值,慢性损伤下Fah^-/-小鼠肝细胞不能衰老可能是其高发肝癌的主要原因。第二,为了明确肝细胞衰老的发生与否确实影响了急慢性肝损伤下肝癌的发生,我们进行了如下实验。首先我们通过肝功能指标检测进一步确认了Fah^-/-小鼠呈现的急慢性肝损伤表型。我们发现完全停药处理下,Fah^-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平显著升高,白蛋白的含量显著降低,表现为急性肝损伤;低剂量处理下Fah^-/-小鼠血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶及总胆红素水平仅有一定升高,而血清白蛋白的含量仅有一定的降低,表现为慢性肝损伤。接下来我们统计了急慢性肝损伤情况下Fah^-/-小鼠的成瘤情况。我们知道急性损伤下Fah^-/-小鼠在6-8周会因毒性代谢产物导致的肝衰竭而死亡,为了延长急性损伤时间到达慢性损伤所需的成瘤时间,即12周和26周,我们在急性损伤下Fah^-/-小鼠损伤到达极限（体重下降至原始体重的70%-75%）时给予3天治疗剂量的NTBC,然后再次停药,如此循环往复使急性损伤时间延长至12周和26周。经统计比较,我们发现急性损伤12周时均未见Fah^-/-小鼠成瘤,而慢性损伤12周时Fah^-/-小鼠成瘤率为100%。急性损伤26周时,Fah^-/-小鼠成瘤率为36%,相对于慢性损伤26周（100%）显著降低,同时急性损伤下Fah^-/-小鼠肝脏中瘤状体的数量、大小均显著低于慢性损伤组。通过上述研究,我们可以看出在不给予任何干预的情况下,急性损伤的Fah^-/-小鼠由于毒性代谢产物蓄积,引起了严重的肝损伤最终导致Fah^-/-小鼠走向死亡;通过在损伤极限时给予短时NTBC使得急性损伤下Fah^-/-小鼠逃避了因肝衰竭而死亡的命运,同时又利用急性损伤的特点保证了小鼠肝细胞衰老及衰老监控的正常激活,使得肝癌的发生得以有效抑制;慢性损伤下Fah^-/-小鼠避免了严重的肝损伤,肝细胞未表现出稳定的衰老表型,Fah^-/-小鼠中DNA损伤的肝细胞不能通过细胞衰老清除,导致了肝癌的发生。进一步,通过收集急慢性各个时间的样本进行RNA-seq分析,通过衰老相关信号通路、肝癌相关信号通路,细胞周期及细胞增殖相关通路变化规律的分析,从整体转录组水平印证了我们之前的实验推测,即肝细胞衰老抑制的同时伴随着肝癌的发生。第三,为了进一步证实慢性肝损伤下肝细胞未发生衰老是肝癌发生的主要原因,我们通过加重损伤程度诱导慢性损伤下肝细胞发生衰老,观察肝癌发生是否受到抑制。选取已经慢性损伤8周的Fah^-/-小鼠,给予完全停药诱导急性损伤4周,诱导肝细胞发生衰老,12周后统计小鼠成瘤情况。我们发现慢性肝损伤8周再诱导急性损伤4周后,Fah^-/-小鼠肝细胞再次呈现衰老表型,即肝细胞衰老被重新启动。而且12周时小鼠成瘤率仅为14.29%,相对于慢性肝损伤12周时Fah^-/-小鼠的成瘤率显著降低。由此可见,慢性肝损伤下的Fah^-/-小鼠,通过诱导急性肝损伤诱导肝细胞发生衰老,可以有效的阻止肝细胞癌的发生。第四,探究细胞衰老抑制肝癌发生的相关机制。细胞衰老是生物体内潜在的肿瘤抑制机制,虽然关于细胞衰老与肿瘤发生的相互关系越来越受到科研工作的重视,但肝细胞衰老抑制肝癌发生关系的机制仍不明确。肝细胞衰老抑制肝癌发生的重要机制是细胞衰老诱导的免疫监控。通过比较慢性损伤和慢性损伤诱导急性损伤肝脏中的免疫细胞数量,我们证实Fah^-/-小鼠肝细胞衰老发生后重新激活了衰老相关的免疫监控,衰老细胞激活CD4⁺Th1细胞,进一步促进NK细胞和巨噬细胞的活化和增值,从而介导了细胞毒效应而清除衰老的肝细胞,从而发挥抑制肝癌的作用。本研究通过应用Fah^-/-小鼠模拟不同损伤程度的急性和慢性肝损伤,使得肝细胞衰老的发生可以调控,作为肝癌模型完美的再现了肝细胞衰老与肝癌发生的关系,清晰表明肝细胞衰老是抑制肝癌发生的主要保护机制,从而为慢性肝损伤下调控肝细胞衰老抑制肝癌发生奠定了理论基础,为实现肝细胞衰老可调控性和肝癌衰老诱导治疗提供了理论依据和实验方案。这对于研究细胞衰老与肝癌发生的关系,对阐明肝癌的发生机制,完善肝癌的治疗方案,具有重要生物学和医学意义。