肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,已成为癌症相关死亡的首要原因,尤其是在亚太地区。一系列慢性肝炎导致肝硬化进而发展为肝癌。慢性肝炎诱发肝细胞受损,引起肝纤维化,破坏正常的肝脏血液系统,进而限制氧气供给,导致肝组织形成乏氧区域。肿瘤细胞的过渡增殖也会引起肝癌组织局部乏氧。乏氧微环境为肿瘤的发生、发展提供了适宜的环境,促进肿瘤恶性演化,包括基因突变与遗传不稳定性、局部浸润与转移、局部复发,以及血管增生等。同时,乏氧区域内的细胞可通过降低DNA损伤自由基的寿命并促进辐射后信号因子的修复,增强肿瘤细胞的辐射抵抗性,严重影响放疗疗效。乏氧已被确定为多个转录因子的强有力刺激。因此,针对这些转录因子,采取乏氧特定基因治疗的新举措,有望为增强肿瘤放疗疗效提供新的途径。然而,肿瘤放疗过程中,受辐射的肿瘤细胞可以通过细胞介质或细胞间隙连接通讯,将应答反应传递至未受辐射的正常细胞,使后者也表现出与受辐射细胞类似的生物学损伤效应,即辐射诱导了旁效应的产生。乏氧状态下辐射旁效应引起的细胞损伤份额要大于有氧状态下的值。因此,深入了解乏氧肝癌细胞辐射旁效应机理,以及正常细胞的自我保护机制,将在增强肿瘤放疗效率的同时,为放疗实施过程中正常组织的防护提供新的思路。本论文通过给予肝癌HepG2细胞SirTl的激动剂(Resveratrol)或抑制剂(Nicotinamide)处理,以细胞存活和微核形成率为检测指标,研究SirTl对乏氧肝癌细胞电离辐射抵抗性的影响,研究SirT1对c-Myc蛋白表达的调控方式,探讨SirTl的脱乙酰化酶功能在辐射抵抗性中的作用机制。其次,采用基因干预的方式,利用肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1进一步研究了SirT1调控不同氧合状态下细胞辐射敏感性、辐射抑制增殖以及诱导凋亡的差异及其分子机制,检测SirTl基因对c-Myc蛋白表达与乙酰化水平的影响,凋亡相关因子Bax与Bcl-2的表达情况,检测不同氧合状态下SirTl基因与c-Myc基因双干扰后受辐射肝癌细胞P53蛋白的表达情况及其磷酸化水平。再次,我们运用条件培养液转移的方式研究受辐射肝癌细胞对正常肝细胞的旁效应损伤以及SirTl在其中的作用,检测c-Myc蛋白的转录活性、细胞内活性氧(ROS)水平的变化情况、旁细胞中的微核形成率,探明SirTl在肝癌细胞辐射旁效应中的作用机制及其传递活性因子引起正常肝细胞DNA损伤的途径。最后,通过改变旁细胞内质网应激反应的程度,研究正常肝细胞内质网应激反应在辐射旁效应中的作用,通过检测旁细胞微核形成率、凋亡形成情况以及内质网应激反应相关信号因子的表达情况,阐明内质网应激反应介导的细胞保护机制在辐射旁效应中的作用。药物水平的研究发现：SirTl激动剂Resveratrol显著降低乏氧状态下受辐射HepG2细胞的微核形成率,而SirT1抑制剂Nicotinamide处理则明显促进受辐射细胞微核的形成。然而,以c-Myc特异性抑制剂10058-F4抑制c-Myc的功能可以完全消除SirT1受抑制诱导的辐射增敏效应。进一步研究发现,Resveratrol通过上调SirT1蛋白的表达及其脱乙酰化酶活性抑制c-Myc蛋白的蓄积,抑制蛋白酶体活性(MG132)能消除SirT1引起的c-Myc蛋白的降解。相反,Nicotinamide通过抑制SirT1蛋白的脱乙酰化酶活性而减缓乏氧状态下辐射诱导的c-Myc蛋白的降解程度。基因水平的研究表明：与对照组相比,SirT1基因过表达(PRK7-SirT1)明显提高受辐射HepG2细胞的存活率与增殖率,而且乏氧状态下SirT1基因的辐射抵抗作用显著高于有氧对照组。相反地,与有氧组相比,乏氧状态下SirT1基因干扰显著抑制受辐射HepG2(shSirT1)与SK-Hep-1 (SirT1 siRNA)细胞的存活,并降低其增殖效率,且c-Myc基因干扰明显降低由于SirT1基因干扰引起的细胞辐射敏感性的增强。进一步研究发现,SirT1基因干扰增强c-Myc蛋白的表达及其乙酰化水平,且乏氧状态下SirT1对c-Myc总蛋白及其乙酰化水平的调控作用较有氧状态下更加显著。SirT1基因干扰还能增强乏氧状态下受辐射细胞P53蛋白的磷酸化水平,而c-Myc基因干扰则显著抑制SirT1基因干扰引起的P53蛋白的磷酸化。此外,SirT1基因干扰明显促进受辐射细胞凋亡因子Bax蛋白的表达,并抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达,而且与有氧细胞相比,乏氧状态下SirT1基因干扰促进受辐射细胞凋亡的能力更突出。辐射旁效应对肿瘤放疗的二次致癌风险评估具有重要意义。研究发现：无论有氧还是乏氧状态下,受辐射肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1均能引起未受辐射正常肝细胞HL-7702微核形成率的上升,诱导旁效应的产生。SirT1基因过表达显著抑制辐射旁效应的产生,而SirT1基因干扰则明显增强辐射旁效应的发生,而且乏氧状态下SirT1基因对辐射旁效应损伤的抑制作用较有氧状态更为显著。C-Myc基因干扰完全抑制由于SirT1基因干扰引起的辐射旁效应的发生。分子水平研究发现,SirT1基因干扰极大程度地促进c-Myc蛋白的转录活性,射线照射进一步增强c-Myc的转录活性,进而提高胞内ROS的含量,且乏氧细胞中这一作用更加显著。然而,c-Myc基因干扰则消除了SirT1基因对受辐射乏氧细胞内ROS水平的调节作用。ROS清除剂DMSO处理有效抑制由于SirT1基因干扰增强的辐射旁效应。研究发现,不仅肿瘤细胞间存在辐射旁效应,肿瘤细胞和正常细胞之间也同样存在辐射旁效应,旁效应的存在在增强放疗疗效的同时,也增大了其对周围正常细胞的损伤程度。我们的研究发现：启动正常肝细胞中的内质网应激反应显著降低肝癌细胞对正常肝细胞的辐射旁效应,包括DNA损伤与细胞凋亡,BiP干扰则明显增强旁细胞中微核的形成率与细胞的凋亡率,而乏氧肝癌细胞受辐射后对BiP干扰的旁细胞的染色体损伤与细胞凋亡率较有氧细胞更严重。此外,肝癌细胞受辐射与否均能诱导BiP干扰的旁细胞凋亡,而启动内质网应激反应则能缓解正常肝细胞的自发凋亡率。分子水平的研究发现,启动内质网应激反应明显上调肝癌细胞辐射旁效应诱导的BiP蛋白的表达,而BiP干扰则显著抑制BiP蛋白的表达。内质网应激反应起始后,BiP蛋白上调PERK蛋白的表达,促进eIF2α的磷酸化水平,同时诱导XBP-1 mRNA的表达,并通过上调IRE1α蛋白的含量促进XBP-1 mRNA的活性剪切。然而,BiP干扰后再启动内质网应激反应则显著增强CHOP蛋白的表达,促进肝癌细胞辐射旁效应诱导的正常细胞的凋亡。概括而言,本文研究表明：SirT1通过自身脱乙酰化酶活性负向调节c-Myc蛋白的表达及其乙酰化水平,影响c-Myc蛋白的转录活性,进而抑制受辐射肝癌细胞P53蛋白的磷酸化水平,促进凋亡因子Bax的表达,抑制抗凋亡因子Bcl-2的累积,实现其对乏氧肝癌细胞辐射敏感性的特异性调节。同时,SirT1通过影响c-Myc蛋白的活性,调节胞内的活性氧水平,抑制乏氧肝癌细胞的辐射旁效应,降低正常肝细胞的DNA损伤。而正常肝细胞也可通过内质网应激反应激活PERK-p-eIF2α、ATF6-XBP-1 mRNA、 IRE1α-XBP-1 mRNA splicing这3条重要的信号通路,抵御肝癌细胞辐射诱导的旁效应,保护自身免受染色体损伤并抑制细胞凋亡。因此,在肝癌的临床放疗中,干预SirT1基因表达可增强肿瘤细胞的辐射敏感性,同时,合理运用内质网应激反应介导的细胞保护机制,有助于增强肝癌放疗效率的同时将辐射旁效应对正常细胞的危害降至最低。