骨质疏松(Osteoporosis)是一种骨的高度重塑性疾病,是由于骨转换之间的失衡而导致的骨密度、骨强度降低,骨的微架构的破坏,以至于易于发生自发性骨折。仅仅在美国就有超过1000万人患有骨质疏松,1800万人有明显的骨质减少,并且这种趋势还在逐年加剧。我国是个人口大国,老龄化人口增多使得骨质疏松症的发生也逐年增高。因此,WHO已把它定为主要的全球公共卫生问题。绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP),是随着年龄的增长,卵巢功能的减退,雌激素分泌的减少而引起的一类骨质疏松症。它严重影响了中老年人的身体健康及生活质量,甚至缩短寿命,增加国家及家庭的财力和人力负担。因此,有效的防治PMOP的发生发展具有深远意义。雌激素是一种女性激素,由肾上腺皮质、卵巢和胎盘所产生的,主要来源于卵巢内膜细胞和卵巢颗粒细胞。在卵泡发育过程中,雌激素在颗粒细胞的刺激下转化为雌二醇(estradiol,E2)发挥生理作用。随着年龄的增长,外界因素的影响,卵巢功能衰退,E2的含量急剧下降从而引起一系列雌激素缺乏性疾病,诸如:更年期综合征等。研究表明雌激素具有促使体内钠水潴留,子宫和卵巢的发育以及骨中钙的沉积,促进骨质致密的作用等。据此,临床上把雌激素替代疗法作为治疗PMOP的主要方案。但是随着研究者对于雌激素的认知增加发现该种治疗方案会增加患者乳腺癌和心脑血管疾病发生的风险,因此妇女健康协会和世界卫生组织提出对雌激素治疗方法的价值和意义需要进行重新的衡量。所以天然的植物雌激素成为了人们关注的热点。雌激素调控体内骨代谢及骨转换主要是通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)调节成骨细胞(osteoblast,OB)的活性而发挥作用。ER是一种存在靶器官细胞内蛋白质分子,可以与雌激素发生特异性结合形成受体复合物,使雌激素发挥其生物学效应。雌激素分为两个经典的核受体,分别是ERα和ERβ,二者的结构相似,具有高度同源性,但是与配体的亲和力不同,二者的功能也不尽相同。成骨细胞中含有ERα和ERβ,新近的研究重点关注ERα的作用,但是一些微阵列研究也表明ERβ在调控基因表达序列中起着重要作用。大豆异黄酮(soybeanisoflavones,si)是一种纯天然的植物性雌激素,能与机体中的雌激素受体结合,具有弱雌激素的作用并且无雌激素的副作用。研究表明si的临床有效性与体内肠道代谢产生雌马酚密切相关。雌马酚(equol,eq)是si体内代谢终产物之一,分子式为c15h14o3,在体内比较稳定,其结构和生物活性与雌激素非常相似,比其前体物大豆甙元更具有生物效应,在人体中,能够产生eq者称为ep+,不能产生eq者称为ep-。雌马酚分为s-eq、r-eq两种同分异构体和外消旋物三种形式存在,尽管s型和r型eq这两种同分异构体都具有雌激素活性,但是它们所表达的亲和力却不一样,研究发现,s-eq与erβ的亲和力较强,而r-eq与erα亲和力较弱,与erβ亲和力更弱,并且人体只能够代谢s-eq。opg/rank/rankl信号通路对于了解ob和破骨细胞(osteoclast,oc)调节骨代谢是一个重大突破,研究发现许多细胞因子、激素等均可通过直接或间接的调节骨保护素(osteoprotegerin,opg),破骨细胞分化因子(kappa-bligand,rankl),调控opg、rankl和核因子-κb受体活化因子(receptoractivatorofnf-κ,rank)之间的关系。rankl和opg在骨组织局部微环境中表达的比例是决定骨吸收还是骨形成的关键分子,由成骨细胞分泌的opg可以竞争性结合rankl,从而阻断rankl与破骨细胞系细胞表面的rank结合位点,使破骨细胞形成受抑。opg/rank/rankl系统直接或间接的影响着老年性和绝经后骨质疏松症等。因此,本研究拟通过模拟绝经后骨质疏松症体内外模型,研究eq对pmop的防治作用,以及opg/rank/rankl信号通路在eq防止pmop中的确切机制,进一步揭示eq的健康保护效应以及为pmop的预防和治疗开辟新的策略和方法。主要实验结果:一、体外实验结果:1.eq及e2对大鼠成骨细胞(ros1728)的增殖效应:用不同浓度(10-8,10-7,10-6mol/l)的eq和e2处理大鼠成骨细胞,且随处理浓度增加,增殖效应更为明显,在一定范围内呈明显剂量效应关系。2.eq和e2对ros1728细胞凋亡的影响:不同浓度的eq和e2及激动剂(dpn)和抑制剂(tam)在ros1728细胞中处理48h后,eq+tam和e2+tam处理组较eq、e2组,eq+dpn组,e2+dpn组和假手术组凋亡率显著增加。3.eq对ros1728细胞周期的作用:不同浓度的eq处理48h后,流式细胞仪上检测显示,细胞g1期比较稳定,从g1期进入s期时,eq组及eq+dpn激动剂处理组的细胞迅速增殖,通过g1期的限制点,在s期时高表达,而各个浓度的eq+tam处理组,在s和g2期被阻滞。4.eq对opg/rank/rankl信号通路基因表达的影响:realtimepcr法检测发现,在ros1728细胞中,通过雌马酚的干预后,rank、rankl和opg因子的mrna表达水平趋于平衡,并且erβ的mrna表达水平比起对照组也有所上升。5.eq对opg/rank/rankl以及相关因子的蛋白表达:westernblot法检测发现,在ros1728细胞中,不同浓度eq处理后,opg、jnk、erα、erβ蛋白表达量显著上升;rank、rankl、蛋白表达量逐渐下降。6.利用sirna沉默erβ、erα后观察雌马酚对opg/rank/rankl表达的影响,通过westernblot检测,结果表明:沉默erβ后,rank和rankl表达量增加,opg表达量减弱,而沉默erα后,无明显趋势变化。二、体内实验结果1.建立雌性大鼠去势模型:假手术组(sham组)、去卵巢模型组(ovx组)、eq高剂量组、eq低剂组、e2阳性对照组。建模8周,利用骨密度仪和大鼠血清雌激素试剂盒检测骨密度和血清雌激素水平来确认建模是否成功,模型建成功以后持续给予eq和e2干预8周。2.eq干预后的形态学检测:通过he染色发现,与sham组相比,给药组股骨干骺端骨小梁丰富且密集,与sham组形态相似,而模型组股骨干骺端骨小梁稀疏,较分散,部分区域骨小梁消失。3.eq干预后大鼠骨密度变化:取各组大鼠股骨在骨密度仪上检测,得到的结果是ovx组大鼠的骨密度(bonedensity,bmd)低于sham组,eq干预后能显著增加ovx大鼠bmd。4.eq对大鼠骨代谢和骨形成血清学指标的影响:分别测定大鼠的血钙、血磷、1,25(oh)2d3、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(pcⅠ)、骨钙素(boneglaprotein,bgp)和e2的指标。ovx组大鼠的血钙、e2,1,25(oh)2d3水平显著下降;血磷,bgp,pci水平明显上升,与sham组和eq干预组的水平相悖。5.eq干预后大鼠骨吸收的血清生化标志物的测定:通过elisa试剂盒测定大鼠血清的抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)、吡啶酚(pyd)和脱氧吡啶啉(dpd)的水平。ovx组大鼠的trap、pyd和dpd的水平明显上升,而sham组和eq组水平明显下降。6.eq干预后大鼠血清中opg和rankl因子的变化:通过elisa试剂盒和realtimepcr的测定,eq处理组大鼠血清opg表达和分泌水平有所上升,rankl表达和分泌水平明显下降。结论:Eq能够促使ROS1728细胞增殖,起到抗凋亡作用,它可能通过OPG/RANK/RANKL信号通路发挥作用,维持骨转化的平衡。表明Eq通过与ERβ结合调节雌激素水平,从而更好的抑制骨质疏松症的发生。同样,体内实验也证明了Eq对去势大鼠骨代谢作用的有效性和稳定性。