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前言 近年，关于白血病与血管生成之间的研究越来越多。大量实验表明白血病病人骨髓微血管密度（MVD）显著高于正常人，许多参与血管生成的细胞因子也明显增高。在参与肿瘤血管生成的诸多细胞因子中，多数学者认为血管内皮生成因子（VEGF）特异性高、作用快。体外实验已证实，白血病细胞本身既分泌VEGF又有功能性VEGF受体（VEGFR）表达，从而证实白血病细胞可以通过自分泌途径维持自身生长，此外尚通过旁分泌途径刺激血管生成和内皮细胞分泌其他细胞因子来间接促进自身的生长。 沙利度胺（反应停）曾一度用于抑制妊娠反应，但因其严重的致畸作用而被废止。近年来人们发现沙利度胺具有抗肿瘤作用，并在多发性骨髓瘤的治疗中取得了满意疗效，也有人单用沙利度胺或联合其他药物治疗白血病，取得一定效果，研究发现沙利度胺通过抑制血管生成而发挥抗肿瘤作用。此外，有学者通过体外实验发现三氧化二砷（As2O3）可以抑制白血病细胞分泌VEGF，并诱导细胞凋亡。 目的 应用白血病细胞体外培养方法观察不同浓度的沙利度胺和As2O3对急性非淋巴细胞白血病（ANLL）细胞分泌VEGF及细胞凋亡的影响，观察二者在抗急性白血病方面的协同性。 实验材料 1．急性白血病病人骨髓细胞 2．器材：细胞恒温培养箱、台式高速离心机、超净工作台、超低温冰箱、相差显微镜、电热恒温干燥箱、酶标仪、流式细胞仪 3．药品：沙利度胺、As2O3 4．其他试剂：细胞培养液、VEGF试剂盒、流式测凋亡相关试剂实验方法 1.骨髓单个核细胞分离与培养 无菌条件下采集骨髓液2祖（sooU肝素抗凝），用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC），洗涤3次，培养于含10%胎牛血清（FBS）、looIU/血青霉素、looIU/血链霉素的RPMll640培养液中，置于37℃、5%C02饱和湿度的培养箱中传代培养。 2.实验分组 取对数生长期细胞，离心去上清，重新加人培养液，以2 x 106/d的细胞浓度加人24孔培养板，分6个实验组，A组:空白对照组;B组:loou酬祖沙利度胺;C组:300u岁d沙利度胺;D组:25urnoF认s:03;E组:loou岁d沙利度胺和25umoF认s:03;F组:300ug/zul沙利度胺和25umoF认5203。置于37℃、5%COZ饱和湿度的培养箱中连续培养72小时。 3.检测VEGF与凋亡 收集细胞悬液离心（巧oor/而n）5分钟，细胞行碘化丙咙（PI）染色用流式细胞仪检测凋亡;用EUSA法检测上清液的VEGF浓度。同时取培养后不同组细胞行涂片、瑞特一姬姆萨染色，于光学显微镜下观察细胞形态。实验结果 1.药物对白血病细胞VEGF的影响: A、B、C、D、E、F6组培养上清液VEGF浓度分别为1640.19土287.10p扩rnl、1596.88土266.18P扩IIil、1242.32士281.95p岁ml、933.99土225.41P扩nil、556.36土250.lsp岁ml、605.86土208.slp扩而。A组、B组之间无统计学差异，A组和C组、B组和C组之间存在明显统计学差异（P<0.05）。A组和D组存在明显统计学差异（P<0.01）。E、F组与A、B、C3组均有统计学差异，F组与D组相比VEGF值有所下降，但无统计学差异（P二0 .052）。 2.药物对白血病细胞凋亡的影响: 单独应用沙利度胺未诱导出细胞凋亡。AsZ 03可以诱导细胞凋亡。两药联合应用细胞凋亡无明显增加。 3.细胞形态学检测: 单用沙利度胺对细胞形态无明显影响，A气03与联合用药组细胞体积明显变小，核浓缩甚至碎裂。讨论 白血病是严重威胁生命健康的恶性肿瘤之一，在儿童和35岁以下成人恶性肿瘤中其死亡率居第一位。目前治疗仍以化疗为主，辅以免疫治疗和支持治疗。初治缓解率可达70一85%，但5一10年无病或带瘤生存率极低。迫切需要新的药物和治疗手段来提高白血病的治疗效果。近年研究发现，初治或复发病人MVD明显增加，参与血管生成的许多细胞因子水平也明显增加，化疗缓解后MVD明显下降，促血管生成因子也趋于正常，上述研究说明血管生成与白血病的发病机制密切相关，抗血管生成治疗可以成为治疗白血病的新靶点。在参与肿瘤血管生成的诸多细胞因子中，多数学者认为VEGF特异性高、作用快。体外实验已证实，白血病细胞本身既分泌VEGF又有功能性VEGF受体（VEGFR）表达，从而证实白血病细胞可以通过自分泌途径维持自身生长，此外尚通过旁分泌途径刺激血管生成和内皮细胞分泌其他细胞因子来间接促进自身的生长。 近年来人们发现沙利度胺具有抗肿瘤作用，并在多发性骨髓瘤的治疗中取得了满意疗效，也有人单用沙利度胺或联合化疗方案治疗白血病，取得一定效果，研究发现沙利度胺通过抑制血管生成而发挥抗肿瘤作用。此外，有人通过体外实验发现AsZO3可以下调白血病细胞vEGF表达。 本实验将AML骨髓单个核细胞与不同浓度的沙利度胺和As:03单独或联合培养，检测培养后上清液中VEGF浓度，并应用流式细胞仪检测细胞凋亡。实验结果表明AML的白血病细胞本身能够分泌VEGF，与上述结果相符;沙利度胺和AsZO3均能抑制白血病细胞VEGF分泌，二者联合应用可以增强抑制作用;AsZO3尚能诱导细胞凋亡，后者可能