论文部分内容阅读
骨与软骨是保证身体运动和提供机械支撑的主要部分。与其他组织器官相同，骨与软骨处于一个动态三维环境内；其内部的流体及溶质输运对维持组织本身的功能及自身活性是必不可少的。本研究从骨内、骨与软骨间的物质输运和关节软骨胞内钙响应三个方面开展工作，尝试能更好的理解物质输运在骨关节系统内的作用。本研究第一部分主要就机械载荷条件和不同生理病理环境对骨的骨陷窝-骨小管系统（LCS）内溶质输运的影响进行量化研究。LCS系统主要由骨细胞外未钙化的胞周基质（PCM）构成。采用本课题组开发的荧光光漂白恢复技术（FRAP）与单轴加载整合加载-成像系统和相应数学模型，在前期实验研究验证的机械加载强化微流体环境的溶质对流的基础上，本研究就不同机械载荷条件（强度、频率）和生理病理条件（弥散性微损伤骨片、基底膜蛋白聚糖缺失基因型小鼠）下骨的LCS系统内溶质输运的量化研究，进而探讨LCS微流体环境内溶质与胞周基质的相互影响。其具体研究内容和结论如下：①采用荧光标记小清蛋白（12.3K Da）作为模型蛋白大分子示踪剂，考察了骨细胞LCS系统内的溶质输运与单轴挤压加载强度（0，2.8或4.8N）和频率（0.5，1或2Hz）的关系。1）依据共聚焦显微采集图像中骨细胞荧光强度的变化，计算了不同加载条件下示踪分子输运率（k）及输运增强度(对流输运率/扩散输运率，k/k0)。结果显示：加载强度增大，溶质输运增强度提高，在0-5N范围内加载强度与输运增强度呈正线性关系。加载频率增加，输运增强度呈负增长趋势。2）结合前期LCS输运数学模拟模型，根据所测LCS系统的解剖学参数，模拟显示了溶质流速与对流输运增强度的高度相关性。依据对应不同加载强度和频率产生的对流输运增强度，计算了相应状态下的小清蛋白的溶质输运速率。4.8N（0.5Hz）的间歇式循环加载产生的平均溶质流速为55.8μm/s；当加载强度降低至2.8N，加载产生的平均溶质流速减少至43.1μm/s。然而随着加载频率依次从0.5、1至2Hz逐渐增高时，溶质平均流速大幅度降低。3）依据PCM内溶质分子的滞后、筛分性，计算和模拟了溶质与基质间相互关系（溶质分子反射系数，Reflection Coefficient）。根据前期估算所得LCS系统微流体环境内流体流速（58.9μm/s），计算了相同表面应变量下小清蛋白的溶质对流速率为53.9μm/s；通过对比流体与溶质流速的不同，获得小清蛋白在本研究小鼠骨LCS内的反射系数约为0.084。②针对弥散性微损伤与线性微裂痕的不同，以荧光素钠为示踪分子模拟骨细胞分泌小分子信号或流体，研究了基质微损伤对LCS系统在动、静态条件下溶质扩散输运的影响。结果显示：1）无外力作用条件下，弥散性微损伤显著增大了LCS系统内的溶质扩散率。2）在高强度拉伸状态下（20，30N），弥散性微损伤区骨LCS内的溶质扩散速率显著提高；但三种拉伸强度（10，20，30N）间的输运增强度无显著差异。③基于基底膜蛋白聚糖（Perlecan/Hspg2，PLN）缺失基因型小鼠的骨组织出现骨小管单位密度下降和骨小管内横断束带单位（基质纤维）数量的减少的现象，就PLN缺失小鼠密质骨内溶质自由扩散和对流输运进行量化。结果表明：1）PLN缺失小鼠骨细胞LCS系统内的大分子和小分子的溶质扩散率均显著性提高，对流输运增强度均呈上升趋势。2）小清蛋白在对照小鼠和PLN缺失小鼠的骨细胞LCS系统内的平均流速分别为48.2μm/s和68.4μm/s。小清蛋白在成年PLN缺失小鼠和正常B6小鼠骨细胞PCM内的反射系数分别为0.057和0.039。PLN缺失小鼠骨的PCM筛分性显著性下降。结果证实了PLN缺失改变骨细胞LCS系统的溶质输运。以上结果说明骨组织LCS系统内的溶质扩散和对流受载荷和生理病理条件的影响。本研究第二部分在前期研究对软骨与软骨下骨的溶质输运原位量化的基础上，就骨关节炎（OA）和正常软骨的解剖学数据进行测试。结果显示：①软骨下骨（SB）和钙化软骨（CC）层的平均厚度和总体厚度在老龄化关节组中显著减小；而DMM的OA组的SB层略微增厚， CC层稍有减小，未钙化软骨层（AC）和总体厚度无差异。②单位面积上的血管数量在老龄化和DMM的CC层的分别增加1和0.5倍；相对于正常小鼠关节潮线（TM）通常无血管存在，老龄化和DMM组TM的平均数量密度分别高达51和18#/mm2。DMM小鼠和老龄化小鼠关节的血管和骨髓空间非常接近钙化软骨。结果提示骨关节炎关节的软骨与软骨下骨间的输运特性可能增强。本研究第三部分就不同浓度二甲基前列腺素（PGE2）对猪关节未钙化软骨层的三个不同层（浅层、中层和深层）的软骨细胞的胞内钙浓度的影响进行考察。研究结果显示，低浓度PGE2（2.5×10-8mg/ml）明显刺激培养和原位关节软骨各层软骨细胞的胞内钙响应；PGE2大幅度正调节了浅层的软骨细胞胞内钙响应，而相对高浓度PGE2（10-6mg/ml）显著性正调节中层软骨胞内钙响应。综合以上检测信息可知，低浓度PGE2在软骨细胞的信号输运通路中具有重要作用。总之，本文三个层次的研究有力地验证了溶质输运在骨、软骨的功能作用中的重要影响力。