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目的:研究特异性小干扰RNA对小鼠结直肠癌细胞株VEGF的抑制作用,并对RNA干扰技术在结直肠肿瘤基因治疗方面的应用可能性进行初步探讨。方法:1.体外转录siRNA:选择血管内皮生长因子(VEGF)为靶基因,针对VEGFmRNA序列,筛选、设计、siRNA相关基因片段,合成DNA寡核苷酸,体外转录合成siRNA。2.构建特异的siRNA表达载体:以pSilencer4.1 CMV neo为载体构建pSilencer4.1CMV neo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA真核表达质粒,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。3.脂质体法将siRNA转染靶细胞:以小鼠结肠癌CT-26细胞系为靶细胞,用脂质体法转染,将siRNA导入细胞。4.观察转染后肿瘤细胞的改变:应用MTT比色分析法检测转染后肿瘤细胞增殖率的变化;半定量RT-PCR检测转染后肿瘤细胞内VEGF mRNA表达水平的变化;Western blot法检测VEGF蛋白表达的变化。结果:1.成功构建针对小鼠VEGFmRNA序列siRNA表达载体:pSilencer4.1 CMVneo-VEGF1/VEGF2/VEGF3-siRNA,并经测序鉴定完全正确。2.体外转录的针对小鼠VEGFmRNA的三个靶位点的siRNA经脂质体转染入小鼠CT-26结直肠癌细胞系后均能有效抑制肿瘤细胞的生长,阴性对照组的siRNA则不起作用。3.转染后24小时利用MTT法检测各组CT-26细胞代谢率的结果表明:V1、V2、V3组肿瘤细胞的生长较Lp组、c组、Nc组被明显抑制,其间差异有统计学意义(P＜0.05),其中,又以V1、V2组肿瘤细胞生长被抑制为明显,与V3相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。4.转染后24小时时V1、V2、V3组siRNA的RT-PCR结果显示:V1、V2、V3组肿瘤细胞VEGF-mRNA的表达较Lp组、c组、Nc组明显下降,其间差异有统计学意义(P＜0.05)。5.转染后24小时时V1、V2、V3组siRNA的Western blot结果显示:三组的VEGF蛋白分泌含量明显低于错义对照组等其他三组,与错义对照组比较有统计学差异。结论:1.应用生物软件设计出来的针对小鼠VEGF的三个靶位点的siRNA均能有效抑制VEGF基因的表达和CT-26细胞系的增殖。2.VEGF是结直肠癌抗血管生成基因治疗的潜在治疗靶点。3.利用RNA干扰技术进行结直肠癌细胞VEGF的沉默有可能成为结直肠癌基因治疗中新型的治疗手段。