布鲁菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌,能够在人畜中引发以波状热、关节炎和流产为主要症状的布鲁菌病,对农业生产和公共卫生造成了巨大的威胁。布鲁菌缺乏经典的毒力因子如外毒素、内毒素、荚膜、溶细胞素等,其毒力主要体现在进行宿主细胞胞内寄生而不引发强烈的免疫应答或诱导宿主细胞死亡,并最终在宿主体内建立慢性感染的能力。因此,对于布鲁菌胞内及体内存活能力相关基因的研究是阐明其致病机制的重要内容。此外,在此基础上构建基因缺失减毒株可用于疫苗研究,为布鲁菌的防控提供重要的技术基础。本研究在前期转座子随机突变筛选减毒突变株的基础上,应用同源重组定向缺失技术,构建了8个突变株,并对其生物学特性进行了鉴定。同时,对其在小鼠体内的长期存活能力,致病力以及免疫保护力进行了研究,为布鲁菌致病机理及其防控技术研究提供了理论基础。本研究中,我们对先前获得的小鼠体内存活能力减弱的转座子随机突变株进行了进一步鉴定。首先通过Southern-blot试验对8个突变株中转座子mini Tn5的插入拷贝数进行检测,随后对单拷贝插入减毒的突变株应用基因组Walking-PCR方法确认转座子的插入位点及突变基因,在此基础上,使用同源重组自杀质粒对各突变基因分别进行定向缺失构建突变株,对其是否影响布鲁菌体内存活能力进行再次验证。结果显示,其中的4个基因缺失株在小鼠体内的存活能力显著减弱,从中我们挑选具有功能注释的BAB_RS22915和BAB_RS27735基因突变株进行了进一步的研究。基因BAB_RS22915编码膜结合型溶菌性糖基转移酶B(MltB)同源蛋白,该基因缺失后,定向缺失株?22915在巨噬细胞RAW264.7中胞内移行能力减弱,感染后24小时无法有效抵抗溶酶体的融合,同时其在RAW264.7胞内存活能力在感染8小时后出现显著减弱,转录组文库深度测序结果显示,该突变株中多个与核酸/氨基酸代谢相关的基因出现显著上调;基因BAB_RS27735编码L-氨基酸ABC转运子底物结合组分的同源蛋白,该基因缺失后,定向缺失株?27735在体外培养条件下对数生长期复制能力显著减弱,同时其在RAW264.7胞内存活能力在感染后2-24小时内显著减弱,随后出现显著回复,转录组文库深度测序结果显示该突变株中其他基因的转录未出现显著差异。这说明布鲁菌BAB_RS22915和BAB_RS27735基因缺失会影响其胞内或宿主体内的存活能力。由于上述两基因的定向缺失株均出现了显著的毒力减弱,本研究对其作为弱毒疫苗候选株的应用价值进行了研究和评价。体内存活试验结果表明,感染后4周内,?22915和?27735均出现显著的存活能力减弱。感染后6周,?22915的体内存活能力进一步减弱,但是?27735则出现了毒力返强现象;病理学检查结果显示,?22915在感染过程中不会对宿主造成实质器官的损伤,而?27735则会导致脾脏和肾脏的病变;免疫保护方面,?22915和?27735均能有效诱导小鼠产生较高水平的体液免疫,对于流产布鲁菌S2308的攻毒,两者也均能在免疫后16周提供很好的保护力,保护效果明显优于经典疫苗株RB51。综上所述,?22915在小鼠体内存活能力较弱、对宿主无致病性,并且具有很好的免疫保护力,因此可作为疫苗候选株进行深入研究。综合全文,本研究在转座子随机突变株研究的基础上,通过Southern-blot和基因组Walking-PCR方法对8个筛选获得的减毒突变株进行了突变基因的鉴定,进一步应用基因同源重组技术构建8个基因的定向缺失突变株,并对其在小鼠体内的减毒特性进行了验证。对其中BAB_RS22915和BAB_RS27735这两个基因定向突变株的进一步研究表明BAB_RS22915基因缺失株具有良好的安全性和免疫保护性,具有更好的疫苗候选株潜力。该研究为布鲁菌致病机制和防控措施的研究提供了重要的理论基础。