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犬骨髓间质干细胞的分离培养扩增与体外分化研究目的：建立犬骨髓间质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）的体外分离、培养、扩增与鉴定方法，并建立MSCs体外定向分化为心肌细胞的方法，对比MSCs体外诱导和非诱导培养向心肌细胞分化的结果。为心肌梗死后心力衰竭的干细胞移植修复治疗奠定基础。方法：抽取犬骨髓血10ml，应用RPMI1640培养液以1∶1稀释骨髓血，用1.074g／ml的percoll细胞分离液进行密度梯度离心，在4℃条件下，以600g离心30分钟分离骨髓单个核细胞；以含15％胎牛血清、100U／ml青霉素及100μg／ml链霉素的RPMI1640培养液培养骨髓干细胞；利用细胞贴壁筛选法分离培养、扩增骨髓间质干细胞；应用干细胞表面标志蛋白检测；应用不同浓度（0，6，8，10，12，14，20umol／L）的化学诱导剂5—氮胞苷对培养早期的MSCs进行诱导分化并连续传代培养4周；未诱导的MSCs培养8周。对分化的犬MSCs于细胞形态学、细胞免疫组化、透射电镜等方面进行鉴定。结果：10ml骨髓血分离出的犬骨髓单个核细胞数约为1.0×108，在含15％血清的RPMI1640培养基上生长良好。犬MSCs孵育24小时即可见细胞贴壁生长，增殖迅速，约72小时即可增殖形成大的细胞克隆，6～7天即可布满瓶底。细胞融合时类似成纤维细胞，呈纺锤状，细胞小而密集，螺旋梳状排列。10ml骨髓血提取的MSCs培养至第3代即可增殖达1.1～1.5×107个细胞。连续培育10代以上，未见细胞形态、增殖特性发生改变，仍维持原代细胞的增殖特性。犬MSCs的表面标志SH2阳性，而CD45阴性。应用化学诱导剂5—氮胞苷6、8或10μmol／L孵育后的MSCs培养2周时，α-actin、Troponin-Ⅰ染色阴性。培养4周时，α-actin染色阳性，Troponin-Ⅰ染色阴性，透射电镜见分化细胞呈梭形，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，可见肌丝结构；其中8μmol／L孵育后培养的MSCs肌丝结构排列规则。检测表明经5—氮胞苷诱导分化的MSCs已具备初步肌样细胞结构。未加入5—氮胞苷诱导分化的MSCs于4周时α-actin、Troponin-Ⅰ免疫组化染色阴性，电镜检查未见肌丝结构形成；而8周时α-actin免疫组化染色阳性，Troponin-Ⅰ阴性，电镜检查亦可见肌丝结构形成。结论：密度梯度分离法与贴壁筛选法能够较好进行犬MSCs的体外分离、培养与扩增，分离培养的细胞具备MSCs的特性。MSCs在5—氮胞苷的诱导下培养4周可定向转化为具有肌丝结构的肌样细胞，而非心肌样细胞；试验进一步发现未经5-氮胞苷诱导的MSCs培养8周后也可转化为具有肌丝结构的肌样细胞。MSCs的成功分离、培养与扩增，为干细胞移植提供了充足的细胞资源。未经5-氮胞苷诱导而体外分化的MSCs更有可能成为心肌梗死后修复心肌的首选干细胞源。犬自体骨髓干细胞经冠脉移植至急性心肌梗死区域的细胞分化研究目的：对比观察自体骨髓单个核细胞和间质干细胞冠脉内移植后的生长分化特点。方法：采用密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞，经过BrdU标记后直接用于移植；或者于体外利用密度梯度离心和贴壁培养法获取自体骨髓间质干细胞，经体外培养、扩增和DAPI标记后再用于移植。结扎犬冠状动脉前降支中段建立急性心肌梗死模型；在不开通冠状动脉的情况下通过梗死相关冠脉内分别注射骨髓单个核细胞（1.0-3.0×108个，单个核细胞组，n=7）和间质干细胞（4.0-6.0×107个，间质干细胞组，n=5）进行自体骨髓干细胞移植，并设置对照组（n=5）。6周时处死动物，在梗死区内取材。通过HE染色、PTH染色、心肌细胞特异性抗体α-actin、Connexin-43免疫组化染色寻找梗死区内存在新生心肌细胞的证据并观察其生长特点。结果：骨髓单个核细胞于体外BrdU标记的阳性率约为50％，自体移植6周后经免疫组化染色可找到BrdU标记阳性的植入细胞存在；而间质干细胞于体外DAPI标记的阳性率约为100％，移植后6周经荧光显微镜可找到DAPI标记阳性的植入细胞存在，α-actin和Connexin43免疫组化染色均为阳性，表明其具有心肌细胞的基本特性，且与周围的宿主细胞形成了缝隙连接。两种干细胞经冠脉注射后，阳性标记的植入细胞均较为分散。结论：心肌梗死后通过冠状动脉内注射法将自体骨髓单个核细胞和间质干细胞移植入梗死相关动脉内，6周后骨髓干细胞均能够进入心肌梗死区并存活；其中骨髓间质干细胞能够分化为较成熟的心肌样细胞，为急性心肌梗死后的干细胞移植修复治疗提供了基本依据。犬自体骨髓干细胞经冠脉移植治疗心肌梗死的疗效目的：观察犬急性心肌梗死后经冠状动脉内注射移植自体骨髓单个核细胞及间质干细胞的疗效。方法：采用密度梯度离心法分离出骨髓单个核细胞；或者在分离出单个核细胞后，进一步于体外培养、扩增，获得间质干细胞。结扎犬冠状动脉前降支中段，建立急性心肌梗死模型（n=23）；在不开通冠状动脉的情况下，通过梗死相关冠脉内分别注射骨髓单个核细胞（n=8）和间质干细胞（n=7），向梗死区行自体骨髓干细胞移植，并设置对照组（n=8）。各组于冠状动脉结扎前（0周）及6周时测定血流动力学和左室功能指标；并采用超声心动图测定左室大小、功能；以及TTC染色测定梗死区面积和梗死范围。通过免疫组化染色，于光学显微镜下计数每个高倍视野（0.2mm2）的瘢痕区毛细血管的数量。通过对比评价成年犬自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的疗效。结果：1．对照组冠状动脉结扎术后6周时心肌梗死面积185.8±153.7mm2，梗死范围2.77％；瘢痕区毛细血管数量为2.03±0.46；血流动力学指标（SBP、DBP、MBP、LVSP、LVEDP）与0周对比无显著差异（P均＞0.05）；左室功能参数±dp／dtmax、±dp／dtmax／LVSP和CO均较结扎前显著下降（P均＜0.05）；超声心动图示LVEF比0周时显著降低（35.28±4.76％vs 49.85±5.42％，P＜0.01），其它指标EDV、ESV、SV、LVEDD均无显著差异（P均＞0.05）。2．与对照组相比，单个核细胞移植组的梗死区面积和梗死范围分别下降了30.9％和35.0％，但无显著性差别（P均＞0.05）；瘢痕区毛细血管数量显著增加，为5.33±0.58（P＜0.01）；6周时血流动力学指标均无显著差异（P均＞0.05）；左室功能参数±dp／dtmax、±dp／dtmax／LVSP和CO等指标均明显升高（P＜0.05～0.01）；超声心动图示LVEF显著升高（46.1±7.71％，P＜0.01），而其他指标均无显著差异（P均＞0.05）。3．与对照组相比，间质干细胞移植组的梗死区面积和梗死范围分别下降了45.9％和48.0％，但无显著性差别（P均＞0.05）；瘢痕区毛细血管数量为5.49±0.50，显著增加（P＜0.01）；6周时血流动力学指标与对照组比均无显著差异（P均＞0.05）。移植组左室功能参数±dp／dtmax、±dp／dtmax／LVSP和CO等指标均显著升高（P＜0.05～0.01）；超声心动图示LVEF比对照组显著升高（48.25±8.57％，P＜0.01），而其他指标均无显著性差异（P均＞0.05）。4．自体骨髓单个核细胞移植组与间质干细胞移植组间相比，各观察指标均无显著差异（P均＞0.05）。结论：经冠脉内注射移植自体骨髓单个核细胞及间质干细胞均能促进新血管生成，缩小梗死面积，并显著改善急性心肌梗死后心脏的收缩及舒张功能；两种不同干细胞的移植效果相当。