研究背景和目的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种致死率很高的恶性肿瘤,其死亡率位居全球癌症相关致死疾病的第三位。现有的诊疗手段并不能有效地改善HCC患者的预后,因此我们希望追根溯源,探寻启动HCC发生的细胞类型,为临床诊疗提供新的理论依据。研究表明,参与肝脏实质重塑的成熟肝细胞以及肝干/祖细胞均可以是HCC的起源细胞。骨髓来源的细胞(bone marrow^-derived cells,BMDCs)也被证实能够进入受损肝脏参与肝细胞的再生。已有报道称BMDCs参与胃癌、皮肤癌、肺腺癌等多种恶性肿瘤的发生,但其在HCC起源中的作用尚不明确。因此,本课题旨在通过以下研究内容探讨BMDCs在HCC起源中的作用,从单细胞水平揭示HCC的发生及演变进程,为临床上HCC的诊疗提供新思路:构建经致死剂量照射和同种异体GFP⁺骨髓移植的二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导小鼠肝癌模型,分离获取肿瘤组织单细胞,分析其拷贝数变异（copy number alteration,CNA）模式,明确肝癌组织中的肿瘤细胞来源;基于CNAs构建系统发生树,探究HCC的进化模式;利用生物信息学分析方法评估DEN诱导形成的小鼠HCC和人HCC的相似性,为实现HCC基础研究向临床应用的转化提供新的理论依据。研究方法1.构建同种异体全骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型——通过鼠尾静脉将GFP转基因雄性C57BL/6小鼠的全部骨髓细胞移植入经致死剂量照射去除本身骨髓细胞的野生型雄性C57BL/6小鼠体内,在此基础上使用DEN诱导小鼠肝癌的形成。通过H&E染色和免疫组化染色明确肝脏所成肿瘤的性质。2.冰冻组织免疫荧光检测肝脏肿瘤组织中GFP和HCC特异性标志物磷脂酰肌醇聚糖3（glypican 3,GPC3）的表达情况。3.制备肿瘤组织单细胞悬液,镜下挑选单细胞,使用多重退火环状循环扩增技术进行单细胞全基因组扩增,构建DNA文库,进行低深度（⁰.3×）的全基因组测序。4.运用生物信息学分析方法检测单细胞的CNA模式,构建CNA事件矩阵,并以此为基础,绘制系统发生树。5.利用巢式PCR技术对肿瘤细胞基因组中的GFP序列进行验证。6.构建去除骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM^-MSCs)的骨髓(CD45⁺骨髓细胞)移植模型,在此基础上使用DEN诱导小鼠肝癌的形成,从单细胞水平探讨BM^-MSCs对HCC发生的影响。7.流式细胞术检测CD45磁珠富集CD45⁺骨髓细胞的特异性。8.构建同种异性骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,利用免疫荧光联合荧光原位杂交技术检测HCC细胞的性染色体构成,进一步验证HCC细胞的来源。9.根据绘制的六只测序小鼠的肝癌系统发生树,探讨HCC细胞CNAs的进化模式。10.利用生物信息学分析方法在多只小鼠共享的CNA区域内寻找和人HCC突变基因相对应的同源基因,分析该模型形成的小鼠HCC和人HCC的相似性。研究结果1.成功构建了同种异体全骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,组织病理学检测证实肝脏所成肿瘤为HCC。2.冰冻组织免疫荧光结果表明肝癌组织中部分肿瘤细胞存在GPC3和GFP的共定位,初步提示BMDCs参与HCC的发生。3.单细胞CNA分析结果显示肝癌组织中存在GFP⁺和GFP^-的肿瘤细胞。4.GFP⁺和GFP^-的肿瘤细胞共享部分CNA区域,提示这些细胞很可能是同一起源,即均来自于骨髓;不同的肿瘤细胞也具有一些各自独特的CNAs,说明肿瘤细胞之间也存在明显的异质性。5.巢式PCR结果证实GFP⁺和GFP^-的肿瘤细胞基因组里均存在GFP序列,进一步说明BMDCs是小鼠HCC的主要起源。6.成功构建了去除BM^-MSCs的骨髓(CD45⁺骨髓细胞)移植后DEN诱导小鼠肝癌模型。结果显示CD45⁺骨髓移植组小鼠的成瘤率明显降低,说明BM^-MSCs对HCC的发生十分重要。7.CD45⁺骨髓移植组小鼠的肝癌组织中仍存在GFP⁺和GFP^-的肿瘤细胞,单细胞CNA分析结果显示这两群细胞具有高度相似的CNA模式,巢式PCR也证实它们的基因组里均包含GFP序列。流式细胞术检测结果发现CD45⁺的供体骨髓中混有少量CD45^-的骨髓细胞,提示可能是未被完全去除的BM^-MSCs启动了HCC的发生。测序结果也提供了另一种可能性,即BM^-MSCs可能不是参与HCC起源的唯一骨髓细胞亚群。8.成功构建了同种异性骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型。通过检测GPC3⁺细胞即HCC细胞的性染色体情况,发现HCC细胞均来自于供体骨髓,并未发生供体骨髓细胞和HCC细胞的稳定融合,说明在本小鼠肝癌模型中,BMDCs直接参与HCC的起源。9.在本小鼠肝癌模型中,肿瘤细胞CNAs的进化模式并非单一,而是同时存在间断进化和渐进进化这两种模式。10.生物信息学分析表明多只小鼠共享的CNA区域内存在与人HCC突变基因相对应的同源基因,体现出本实验模型所形成的小鼠HCC和人HCC具有一定的相似性。研究结论本课题成功构建了骨髓移植后DEN诱导小鼠肝癌模型,通过分析肝癌单细胞的CNA模式,发现BMDCs是HCC的主要起源细胞。我们推测化学致癌物DEN引起的肝损伤会募集BMDCs入肝,BMDCs通过转分化为肝细胞参与肝脏再生。长期暴露在这种化学致癌环境中,这些细胞更容易转变为肿瘤细胞而启动HCC的发生。在本研究模型中,BM^-MSCs这一骨髓细胞亚群对HCC的发生十分重要。生物信息学分析结果表明在本小鼠肝癌模型中,渐进式和间断式的CNA进化模式同时存在;本实验模型里的小鼠HCC和人HCC具有一定的相似性。BMDCs是HCC起源细胞的发现会加深人们对HCC发病机制的认识和理解,有利于新的治疗靶点或治疗手段的产生。