蛇毒中含有多种具有药理作用的多肽及蛋白质,三指蛋白属于其蛋白家族中的一种。近年来,三指蛋白止痛无成瘾性、无依赖性,用量少,镇痛作用时间长等优点已不断引起人们的关注,揭示其镇痛机制,从而开发出选择性高、安全性好、副作用小的镇痛药已成为亟待解决的问题。本文旨在探寻基于蛇毒三指蛋白的镇痛小肽并研究其镇痛作用,将眼镜蛇毒进行胃蛋白酶水解后分离纯化,寻找可口服并能快速起效的镇痛小肽,为研究三指蛋白的镇痛机制奠定一定基础并为相关研究提供参考依据。本实验首先将眼镜蛇蛇毒进行沸水浴处理以获得含有三指蛋白在内的热稳定性高的碱性蛋白混合物,再模拟胃部条件不同时间梯度水解眼镜蛇蛇毒,用热板法检测不同水解时长的产物的镇痛活性;采用高效液相色谱对水解产物进行分离纯化以及纯度鉴定;用热板法观察所得小肽的镇痛作用。结果表明眼镜蛇蛇毒经胃蛋白酶适当水解后灌胃有显著镇痛效果,并且水解6 h后对小鼠灌胃的镇痛效果最好,10 min即可起效并且药效稳定维持至48h以上;腹腔注射组与灌胃组结果相反,随着水解程度的加深至彻底水解,腹腔注射水解混合小肽基本无镇痛效应。HPLC分离纯化后在12 min左右收集的组分经热板法验证与之前结果较一致,经纯化后进行MALDI-TOF鉴定,其分子量约为1267.727,比对数据库确定其氨基酸序列为KDHRGTRIER,合成此段小肽,通过对小鼠灌胃的镇痛实验效果来看,10 min即观察到明显痛阈提高,镇痛持续时间较长,可维持48 h,小鼠痛阈值可提高60%左右,与之前的结果较一致。初步认为我们已获得快速起效、镇痛药效时间长且可口服的镇痛小肽,其镇痛机制尚待进一步研究。