脑血管病已经成为我国人口的第一位致残和致死性疾病，并且发病数量还有逐年增多的趋势。过去几年的流行病学研究结果表明，我国每年有160万～200万新发脑卒中的病例，现存的脑血管病患者700余万人，其中约70%为缺血性脑卒中患者。缺血性脑卒中的损伤危害极大，能够引起严重的神经功能障碍，降低中患者的生活质量，病情严重的可危及生命。尽管已证实组织型纤维蛋白酶原激活剂（rtPA）能够作为一种有效的药物治疗缺血性脑卒中疾病，但有效治疗时间窗短（3.5h以内），对治疗对象要求高的缺点，使其在临床治疗工作中运用受限（少于3%）。研究脑缺血再灌注损伤的发生发展机制，寻找有效的预防及治疗手段一直是神经科学研究的前沿性、热点性课题。近年来已证实多种非缺血的预处理方法都能够改善脑缺血再灌注损伤，我们科研究发现电针预处理能够减轻脑缺血再灌注对神经功能的损害，改善神经功能，诱导脑缺血耐受。新近的研究结果证实电针预处理可能通过内源性大麻素系统及其相关信号蛋白发挥神经保护作用，但其确切机制仍需进一步阐明。信号转导及转录激活因子3（STAT3）在细胞生存和增殖调节过程中发挥十分重要的作用，细胞的损伤能够激活STAT3，使其发生磷酸化。实验中证实磷酸化的STAT3分子能够有效发挥神经保护作用，但该因子是否在电针诱导的脑缺血耐受保护效应中发挥作用仍不清楚，本研究以大鼠脑中动脉阻闭（Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO）为脑缺血再灌注损伤模型，观察电针预处理后大鼠脑缺血再灌注损伤过程中磷酸化STAT3分子的表达及其神经保护作用，并初步探讨其在电针预处理脑保护效应中的调节机制。实验一电针预处理脑保护作用及电针预处理对缺血后磷酸化STAT3分子表达的影响方法1.电针预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用清洁级雄性SD大鼠24只（280-320g），随机分为3组：假手术组（Sham）、单纯缺血再灌注组（MCAO）和电针预处理组（EA）。动物经历2h缺血后于再灌注72h处死，通过脑梗死容积和神经行为学评分的测定观察电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。2.电针预处理脑缺血再灌注损伤后磷酸化STAT3分子的表达（pSTAT3）雄性SD大鼠24只，分组同1。缺血2h后分别于再灌注6h和24h处死，进行蛋白免疫印迹(Western blotting)，检测再灌注损伤后pSTAT3表达情况。3.电针预处理脑缺血再灌注损伤后活化STAT3表达的定位雄性SD大鼠12只，分组同1。缺血2h再灌注6h后将动物处死，制作冰冻切片，通过免疫荧光双标染色对目的蛋白进行定位。实验二磷酸化STAT3分子参与电针预处理诱导的脑缺血耐受方法1. STAT3分子活化抑制剂PpYLKTK对pSTAT3表达的影响雄性SD大鼠12只，随机分为3组：Sham组、EA+PBS组和EA+Pp组。缺血2h再灌注6h处死进行蛋白免疫印迹(Western blotting)，检测再灌注损伤后pSTAT3表达情况。2. STAT3分子活化对电针预处理脑保护效应的影响雄性SD大鼠32只，随机分为4组：Sham组、MCAO组、EA+PBS组和EA+Pp组。动物经历2h缺血后于再灌注72h处死，通过脑梗死容积和神经行为学评分的测定观察STAT3分子活化同电针预处理脑保护效应之间的关系。实验三磷酸化STAT3分子对神经细胞凋亡的影响方法1. STAT3分子活化对电针预处理保护效应中神经细胞凋亡的影响雄性SD大鼠16只，随机分成4组：Sham组、MCAO组、EA+PBS组和EA+Pp组，缺血2h再灌注24h后将动物处死，进行TUNEL和caspase3阳性细胞染色计数，观察STAT3分子活化对电针预处理脑保护效应中凋亡细胞数量的影响。2. STAT3分子活化在电针预处理保护效应中凋亡蛋白表达的影响雄性SD大鼠16只，分组同1，缺血2h再灌注24h后将动物处死，进行蛋白免疫印迹(Western blotting)，检测STAT3分子活化对电针预处理脑保护效应中凋亡蛋白表达的影响。实验四电针预处理诱导脑保护效应中STAT3分子磷酸化的调控机制方法1． CB1受体拮抗剂AM251及干涉RNA对电针预处理后活化STAT3分子表达的影响雄性SD大鼠32只，随机分为8组：其中MCAO组、EA组、EA+AM251组以及EA+vehicle组用于观察AM251参与电针预处理后对pSTAT3(Ser727)表达的影响，另外MCAO组、EA组、EA+CB1-siRNA组以及EA+control-siRNA组用于观察干涉RNA参与电针预处理后对pSTAT3(Ser727)表达的影响。缺血2h再灌注6h处死进行Western blotting，检测再灌注损伤后pSTAT3表达情况。2． CB1受体激动剂WIN55,212-2和ACEA对电针与处理后活化STAT3分子表达的影响雄性SD大鼠24只，随机分为6组：其中MCAO组、MCAO+WIN组、MCAO+vehicle组用于观察WIN55，212-2对pSTAT3(Ser727)表达的影响，另外MCAO组、MCAO+ACEA组、MCAO+vehicle组用于观察ACEA对pSTAT3(Ser727)表达的影响。缺血2h再灌注6h处死进行Western blotting，检测再灌注损伤后pSTAT3表达情况。结果1．电针预处理后脑缺血再灌注损伤的变化及对STAT3分子磷酸化水平的影响EA组大鼠的NDS评分明显优于MCAO组（P<0.01），并且EA组大鼠脑梗死容积显著降低，优于MCAO组（P<0.001）。缺血2h再灌注6h后EA组较MCAO组和Sham组pSTAT3(Ser727)表达量显著升高（P<0.001）。再灌注24h后EA组和MCAO组中pSTAT3(Ser727)表达量较Sham组显著升高（P<0.05），但EA组和MCAO组之间没有统计学差异。免疫荧光双标染色结果显示，缺血再灌注损伤后pSTAT3(Ser727)主要表达于NeuN阳性的神经元内，胞浆和胞核内都有表达。2． STAT3活化抑制剂PpYLKTK对电针预处理脑保护效应的影响电针后1.5h给予STAT3活化抑制剂PpYLKTK可以显著下调EA组大鼠缺血再灌注6h后pSTAT3（Ser727）的表达水平（P<0.001）。PpYLKTK可以部分逆转电针预处理的脑保护效应，缺血2h，再灌注72h后,EA组神经行为学评分显著优于MCAO组以及EA+Pp组（P<0.001），并且脑梗死容积也显著小于MCAO组以及EA+Pp组（P<0.001）。3. STAT3磷酸化水平的变化对缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响PpYLKTK能够增加缺血脑组织中神经细胞的凋亡数量，缺血2h，再灌注24h后,EA组大鼠脑缺血再灌注损伤组织中Tunel染色阳性细胞数显著低于EA+Pp组和MCAO组（P<0.01），同时active-caspase-3阳性细胞数也低于EA+Pp组和MCAO组（P<0.05）。缺血2h，再灌注24h后,MCAO组大鼠BAX/Bcl-2比值较Sham组显著升高，电针组较MCAO组明显降低，而EA+Pp组较EA组则明显上调Bax/Bcl-2比值。4.电针预处理脑保护效应中对下游STAT3分子磷酸化的调控机制缺血2h再灌注6h后EA+CB1-siRNA和EA+AM251组pSTAT3(Ser727)表达量较EA和EA+vehicle组降低（P<0.001）。缺血2h再灌注6h后WIN55,212-2组和ACEA组pSTAT3(Ser727)表达量较MCAO组和MCAO+vehicle组显著升高（P<0.01）。结论电针预处理通过中枢神经系统内源性大麻素受体CB1调节下游STAT3分子的磷酸化水平介导缺血再灌注损伤后的神经保护作用，改善脑缺血再灌注损伤的愈后，本实验进一步阐明了电针预处理脑保护效应的机制，为临床实验研究提供了理论依据。