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结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病，目前全球有1／3人口感染MTB，每年新发生的TB病例约1000万，每年约300万人因TB而死亡。我国TB患者数量居世界第二位，据2000年全国TB流行病学调查，我国现有MTB感染者4亿人，TB患者500万人，每年死于TB的人数达25.6万人。卡介苗(BCG)是目前唯一的预防TB的疫苗，但其保护效果不稳定(保护率为0-80％)，同时由于MTB耐药株的流行与HIV的合并感染以及人口流动的增加等因素，进一步加剧了MTB对人类的威胁，因此迫切需要研制新型的更有效的TB疫苗。 MTB早期培养滤液蛋白(CFP)中的Ag85B和ESAT6是重要的保护性抗原，广泛用于新型TB疫苗研究。本研究先后构建了融合表达Ag85B和ESAT6基因的亚单位疫苗、基因疫苗以及重组BCG疫苗，并比较了各自诱发的细胞免疫应答水平和对感染小鼠的保护力，以期为TB的防治提供新型疫苗。 设计了含不同酶切位点的ag85b和esat6引物，采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段，将目的片段与pGEM-T-easy载体连接后测序，PCR获得的ag85b和esat6序列与GenBank报道的完全一致。将测序正确的ag85b和esat6按照不同的酶切 第四军医大学博士学位论文位点联合克隆入PProEx HT表达载体，成功诱导表达融合蛋白，同时与6Xhis的单克隆抗体(mAb)进行W己stem一blot分析，结果显示，在相对分子量约37KD处有与6 X his n1Ab特异性结合带，与预计大小相吻合。用Ni一NTA亲和柱可获得纯化的表达产物。采用皮下包埋的方法，将预先转移到硝酸纤维素膜上的纯化蛋白免疫小鼠三次，每次间隔2周，用MTB的CFP作为抗原，ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度，结果融合蛋白Ag85B一ESAT6和ESAT6一Ag85B免疫小鼠血清特异性抗体滴度分别为l:1000和l:5000。 为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答，最后一次免疫完成四周后，分离免疫小鼠的脾淋巴细胞，体外用CFP刺激，结果融合蛋白Ag85B一ESAT6和ESAT6一Ag85B诱导产生的IFN一Y分别为3.51士O.3Ong/ml和4.05士o.41ng/ml，显著高于生理盐水对照组(0.5士o.25ng/ml，P<0.05)，但不及BCG免疫组(5 .55士0.31n岁ml)。MTT法检测淋巴细胞增殖反应，融合蛋白Ag85B一ESAf6和ESAT6一Ag85B免疫组刺激增殖指数分别为2.4和2.6，而生理盐水组只有0.9(P<0.05)。免疫完成后第四周，用10，cFuMTB毒株H37Rv经尾静脉感染免疫的BALB/c小鼠，计数脾脏细菌负荷数:与生理盐水对照组相比，融合蛋白免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(差值分别为1 .27109，。和1 .16109，。，p<0.05)，但与BCG免疫组(差值为2.22 2091。)相比脾脏细菌负荷减少甚微。 将叩召站和esat‘按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体peDNA3，分别命名为Az一peDNA3一E;和Ez一peDNA3一AF。将重组质粒Az一PcDNA3一EF和Ez一PcDNA3一AF电转CHO细胞， Rl’- pCR检测融合蛋白mRNA的表达，用间接免疫荧光可以在转染重组质粒的CHO细胞内检测到较强的绿色荧光，证实CHO细胞内融合蛋白的表达。用上述两种重组质粒分别免疫BALB/。小鼠三次，每次间隔两周，最后一次免疫结束后，ELISA测定特异性抗体的滴度，结果Az一peDNA3一EF和Ez一PcDNA3一A;质粒免疫小鼠血清的特异性抗体滴度分别为1:1000，和l:1500。分离小鼠的脾淋巴细胞，并在体外用CFP刺激，结果Az一peDNA3一E;和Ez一PcDNA3一AF质粒免 5 第四军医大学博士学位论文疫小鼠的脾淋巴细胞增殖显著，其刺激指数分别为2.2和2.4(生理盐水组淋巴细胞刺激指数只有0.9):脾淋巴细胞悬液中诱发的IFN一丫分别为5.48士o.38ng/ml和5.76士0.51ng/ml，显著高于生理盐水免疫组(0.5士0，25ng/ml，p<0.05)，但与BCG免疫组(5.55士0.3ing/ml)无显著差别;免疫完成后第四周，用105cFu MTB毒株H37Rv经尾静脉感染BALB/c小鼠，结果与生理盐水对照组相比，质粒Az一PcDNA3一E;和Ez一peDNA3一AF免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(差值分别为1.6810910和1.81109，o)，但不及BCG免疫组(差值为2.221091。)。 采用PCR方法从MTB毒株H37Rv~DNA扩增出热休克蛋白Hsp60基因及其信号肤序列。一ss，将测序正确的hsP翻和a一ss分别克隆入E，coli一召c6穿梭载体pOLYG中，构建分枝杆菌分泌表达载体pDE22，按相应的酶切位点将。98肠和esat‘按照不同的连接方式联合克隆入pDE22载体，分别命名为pDE22一Ag85B一ESAf6和pDE22一ESAT6一Ag85B，将纯化的重组质粒电穿入BCG，经潮霉素抗性筛选和PCR的方法鉴定出含目的基因的重组BCG阳性克隆。将含目的基因的重组BCG大量培养，收集培养上清，经sns一队GE和Westem一blot分析，确定吧召万b和esat‘在BeG中的融合表达。 取基因型和表型鉴定正确的两种重组BCG分别免疫小鼠，四周后，分离脾淋巴细胞，在体外用CFP抗原刺激，一部分用做测定淋巴细胞增殖指数?