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四溴双酚A(Tetrabromobisphenol A,TBBPA)是具有内分泌干扰毒性的环境新型潜在的拟增热点POPs,是目前应用最多的,产量较高的一种小分子溴系阻燃剂,广泛用于各种电子电器产品、纺织品、泡沫家具及建筑材料等。TBBPA不仅暴露人群广泛(包括职业和普通人群),而且暴露方式多样(包括皮肤接触、饮食摄取、空气吸入),在很多自然环境、社会环境和多种生物有机体中普遍检出,对环境和生物健康产生严重而持久的影响。TBBPA现已被国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)在2016年列为可能的2A级致癌物,其暴露增加子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)的发病风险,但目前关于TBBPA诱发子宫内膜癌发生发展的肿瘤机制尚无明确认识急需深入探究。肿瘤包括实质与间质。肿瘤的间质在肿瘤微环境中以癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)为代表的多种辅助性细胞分泌细胞因子的形式协助实体瘤的构建,CAFs是由肿瘤分泌因子诱导的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)等多种干细胞分化形成,BMSCs能够迁移至实体瘤部位补充肿瘤微环境中被消耗的CAFs。目前,关于环境污染物的肿瘤效应主要集中在对实体肿瘤的研究,关于肿瘤微环境的报道比较少,因此本研究基于TBBPA诱导BMSCs分化为CAFs,建立肿瘤微环境体系,探究TBBPA暴露促进人子宫内膜癌细胞增殖的效应和潜在的分子机理,丰富和完善环境因子的肿瘤效应评价体系。研究内容包括以下几部分:1.人体血液检出水平的TBBPA(1.00E-9~1.00E-7 mol/L)暴露BMSCs 6 d和12 d后,实时荧光定量PCR实验检测BMSCs的标志物Thy-1和TBBPA诱导的BMSCs分化为CAFs的标志物a-SMA、Fap、PDGFRA转录水平的情况。研究结果证明,TBBPA暴露明显降低了BMSCs标志物Thy-1在mRNA水平的表达,而上调CAFs分化标志物a-SMA和Fap mRNA的表达。这一结果在Western blotting检测a-SMA、Fap蛋白含量的实验和免疫荧光定位检测a-SMA的实验中得到验证,表明人体血液含量的TBBPA暴露能够诱导BMSCs分化为CAFs。2.为了进一步探讨TBBPA暴露是否通过诱导BMSCs定向分化为CAFs调控肿瘤微环境,进而促进子宫内膜癌细胞的增殖,我们采用TBBPA诱导的CAFs构建了3种CAFs-EC间接暴露模型。研究收集了TBBPA暴露BMSCs分化后的CAFs上清,并配制成上清含量为25%和50%的条件培养基暴露Ishikawa细胞。CAFs上清对子宫内膜癌细胞的增殖效应分别被MTT实验、软琼脂克隆形成实验和集落形成实验检测。结果表明TBBPA暴露后的CAFs的上清上调了Ishikawa细胞的相对克隆率、集落形成率和细胞存活率,证明BMSCs被TBBPA暴露后通过分泌细胞因子促进子宫内膜癌细胞的增殖。3.为了证明TBBPA暴露诱导的CAFs通过旁分泌和细胞直接接触作用促进子宫内膜癌细胞的增殖,我们构建了2种CAFs-EC直接暴露模型,通过检测CAFs旁分泌作用的transwell共培养实验和检测CAFs-EC直接接触作用的共培养实验探究Ishikawa细胞的增殖情况。结果显示,CAFs与Ishikawa细胞进行transwell共培养后,Ishikawa细胞增殖率明显升高,表明TBBPA诱导的CAFs通过旁分泌作用促进子宫内膜癌的增殖。此外CAFs和Ishikawa细胞共同培养于24孔板后,Ishikawa细胞增殖率显著升高,表明TBBPA诱导的CAFs通过细胞直接接触作用促进子宫内膜癌细胞的增殖。4.综上研究表明,由TBBPA暴露介导的BMSCs通过分化为CAFs促进子宫内膜癌细胞的增殖,实验进一步探究TBBPA暴露诱导BMSCs分化的分子毒性机理。由于BMSCs分化的调控与PI3K/Akt、NFκB和TGF-β/Smad通路有关,因此我们检测了这些通路的靶点蛋白TGF-β受体、p-Smad2/3、Smad2/3、p-AKT和NFκB。研究发现,在TBBPA暴露诱导的CAFs中,TGF-β受体和p-Smad2/3的表达明显上调,表明TBBPA可能通过激活TGF-β/Smad通路,促进BMSCs分化为CAFs。为了验证TBBPA是否通过介导TGF-β/Smad通路诱导BMSCs的分化,我们采用TGF-β受体的抑制剂SB431542和TBBPA共同处理BMSCs,结果表明当TGF-β受体被抑制后,p-Smad2/3和CAFs分化标志物a-SMA、Fap的蛋白表达水平均明显降低。本部分研究表明TBBPA通过介导TGF-β/Smad通路激活p-Smad2/3的活性,进而诱导BMSCs分化为CAFs。以上研究表明,TBBPA暴露诱导BMSCs分化为CAFs,通过CAFs的旁分泌和细胞直接接触作用促进子宫内膜癌细胞的增殖,这是通过TBBPA激活BMSCs的TGF-β/Smad通路完成的。本研究探讨了TBBPA通过调控BMSCs分化,影响肿瘤微环境变化,从而促进子宫内膜癌细胞增殖的毒性机理,补充和完善了环境毒性因子TBBPA的肿瘤效应评价体系。