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环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)是一类能干扰机体天然激素合成、分泌、转运、结合或清除的各种外源性物质。这类物质可导致动物和人类生殖功能障碍、生殖能力下降、幼体灭亡甚至灭绝等,其对人群健康的危害受到国内外专家广泛关注。众多环境内分泌干扰物中以邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters, PAEs)污染最为严重,邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)是其代表物之一。本室前期研究发现流经重庆主城区的嘉陵江及长江水中,DBP检出量最高可达9.48μg/L。而化学安全国际计划(the International Program on Chemical Safety,IPCS)所估计的饮用水中DBP暴露量小于1.0μg/L。美国国家毒理学计划(National Toxicology Program, NTP)的研究确认DBP具有显著的雄性生殖毒性及发育毒性。大量动物资料显示,大鼠宫内DBP暴露可致雄性子代睾丸萎缩、附睾畸形、隐睾症和尿道下裂等病变。有研究发现,DBP暴露不仅影响F0代大鼠,还可影响F1代乃至F2代的生殖和发育。IPCS综述了关于DBP致突变性的文献后认为DBP不具有遗传毒性,因此损伤机制有可能来自于遗传外机制。近年来,表观遗传学(epigenetics)已成为基因表达调控的研究热点,它是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因的功能发生了可遗传的改变,并最终导致表型的变化。DNA甲基化是表观遗传学的重要机制之一,在胚胎早期发育、组织特异性的基因表达和大部分基因沉默中起关键作用。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶介导的,目前发现哺乳动物体内具有转甲基活性的酶有Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。DNA甲基转移酶的改变可导致基因组DNA甲基化的异常和表遗传调节的紊乱。因此,我们推测DBP的雄性生殖毒性可能是通过影响DNA甲基转移酶表达实现的。目前关于DBP宫内暴露对雄性仔鼠生殖系统影响的研究使用的剂量都比较高,大多数都在500mg/kg以上,远远超过了人类可能的最大摄入量(113μg/kg)。而实际上环境和生物体内所含的DBP浓度经常是非常低的,所以研究低剂量下DBP的生物学效应更有意义。本研究以未观察有害效应水平(NOAEL)50mg/kg为最低剂量对亲代孕鼠进行宫内暴露,验证DBP对F1代雄性大鼠的生殖影响,观察DBP对雄性的生殖损伤能否持续至F2代,并通过分析F1代和F2代睾丸DNA甲基转移酶的基因表达改变,探索DBP对雄性生殖损伤是否通过表遗传学机制起作用。方法:1.多代繁殖动物模型:SPF级SD孕鼠72只,随机分为五组,分别为玉米油(Corn oil)对照组(相对于DBP的溶剂对照)、DBP 50mg/(kg·d)组(简称DBP 50)、DBP 250mg/(kg·d)组(简称DBP 250),每组各20只孕鼠,DMSO对照组(相对于Vinclozolin的溶剂对照)、Vinclozolin 100mg/(kg·d)组(简称Vin 100)每组各6只孕鼠。自妊娠第8天(GD8)至妊娠第21天(GD21),按2ml/kg灌胃量每日对亲代孕鼠经口灌胃染毒。同剂量组不同窝别的F1代仔鼠于出生后第90天按雌雄比1:1交配产生F2代仔鼠。2.观察指标:1)F0代及F1代孕鼠:大鼠一般生长情况、体重增长情况、繁殖功能(雌鼠妊娠时间、产仔数、活仔数、仔鼠出生窝重、仔鼠出生平均体重、性别比率、哺育4天存活率)和脏器重量等。2)F1代及F2代雄性仔鼠:仔鼠一般生长情况、出生后4天肛殖距、脏器重量、睾丸及附睾病理组织学观察、精子评价。3)采用逆转录聚合酶链扩增(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)法检测F1代及F2代雄性仔鼠睾丸组织中DNA甲基转移酶mRNA的表达。3.统计分析用SPSS11.5统计软件对数据进行统计分析,计数资料用卡方检验,计量资料用方差分析,数据用x±s的形式表示。P<0.05表示差异有统计学意义。结果与讨论:1.DBP宫内暴露多代繁殖动物模型的建立整个实验期间,大鼠饮食饮水状况正常,生长情况良好,根据OECD实验指南和Skinner等的四代动物模型建立DBP宫内暴露多代繁殖动物模型,所得结果与相关多代繁殖实验大体一致,说明成功建立了多代繁殖动物模型。与玉米油对照组相比,DBP50组F1代仔鼠的出生体重以及肝脏系数降低(P<0.05),刺激F1代孕鼠哺乳期体重增长(P<0.05),这有可能是DBP低剂量的hormesis效应;F2代肾脏系数增加(P<0.05)。DBP250组,F0代孕鼠哺乳期体重降低,F1代仔鼠出生窝重以及PND21和PND28的体重降低(P<0.05),说明DBP可影响F0代孕鼠的繁殖以及F1代仔鼠的生长。F1代雄性仔鼠心脏系数增加,F2代雄性仔鼠肝脏系数降低,睾丸脏器系数增加(P<0.05)。其余指标各组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.DBP宫内暴露对F1及F2代雄性仔鼠生殖系统的影响与玉米油对照相比,DBP50组F2代精子体、尾部畸形率增加(P<0.05),但总畸形率差异无统计学意义(P>0.05)。DBP250组F1代雄性仔鼠肛殖距缩短(P<0.05),精子数目明显减少(P<0.01),精子头部、体部及总畸形率增加(P<0.05)以及睾丸曲细精管变性率增加;F2代雄性仔鼠精子头部及总畸形率增加(P<0.05)。这说明DBP对F1及F2代雄性仔鼠生殖均有损伤作用,对F2代的损伤仅观察到精子畸形率的增加。3.DBP宫内暴露对F1及F2代雄性仔鼠睾丸DNA甲基转移酶mRNA表达的影响F1代雄性仔鼠:与玉米油对照组相比,DBP各剂量组Dnmt1基因表达差异无统计学意义;与DBP50组相比,DBP250组Dnmt1基因表达显著升高(P<0.05)。与玉米油对照组相比,DBP50组和DBP250组Dnmt3b基因表达均降低(P<0.05)。与DMSO溶剂对照组相比,阳性对照组Vin100的Dnmt1和Dnmt3b基因表达显著降低(P<0.05)。F2代雄性仔鼠:与玉米油对照组相比,DBP50组Dnmt3b基因表达降低(P<0.05)DBP250组Dnmt1基因表达升高,Dnmt3b基因表达降低(P<0.05)。与DMSO溶剂对照组相比,阳性对照组Vin100的Dnmt1基因表达显著增加(P<0.05)。以上结果表明,DBP宫内暴露对F1代及F2代大鼠睾丸Dnmt1和Dnmt3b基因表达均有影响。结论综上所述,我们发现宫内暴露DBP能干扰F0代孕鼠的生长与繁殖,引起F1代与F2代雄性仔鼠心、肝、肾、睾丸脏器系数的改变,是否毒性所致还需进一步观察。DBP对F1代雄性生殖系统损伤明显,表现在肛殖距缩短、精子数目减少、精子畸形率增加以及睾丸曲细精管变性率增加,但F2代仅观察到精子畸形率增加。DBP增加F1代与F2代雄性仔鼠睾丸组织Dnmt1的mRNA表达,降低Dnmt3b的mRNA表达。结合Dnmts的mRNA表达情况和生殖系统出现的损伤结果,我们推测DBP有可能通过改变Dnmts的表达,导致某些基因的过表达或抑制,从而使雄性子代生殖系统受损。创新性1.本研究观察了DBP亲代宫内暴露对SD大鼠三代生殖及发育的影响,发现DBP对F1代雄性仔鼠生殖系统有明显损伤,对F2代雄性仔鼠仅观察到精子畸形率的改变。我们还发现DBP不仅损害雄性子代的生殖系统,还引起其他实质性器官的发育异常。2.本研究在体内动物实验中观察到宫内暴露于DBP可导致能延续至子二代的DNA甲基转移酶的异常改变。研究不足之处由于时间的限制,我们的研究还有不完善的地方,比如Dnmts在蛋白质水平上的验证工作,以及睾丸发育相关基因启动子序列的DNA甲基化改变等。下一步计划下一步我们打算利用甲基敏感任意引物聚合酶链法对基因组DNA差异甲基化片段进行筛选,旨在能筛选到高甲基化或低甲基化片段,再进行Blast序列比对分析,确认具体是哪些基因或基因的调控区发生了改变。另外选取与睾丸发育的相关基因,分析其启动子序列DNA甲基化的改变,以更深入地了解DBP引起雄性生殖损伤的表遗传效应。